虽然是5年前的研究，但现在看了，对报国自然还是大有帮助……

然后就想起来 5 年前的一篇文章了：

这是一篇发表在疫情前的研究，那时候 Cell Research 的影响因子已经是 20 分了，现在是 28+ 。之所以想起来这篇文章，是当时看这篇文章时，研究团队在探索 CircRNA 的作用机制时体现出的严谨（当然很多主刊或者大子刊级别的高质量研究在严谨这块确实做的很好）， 正好是大家报国自然的时候需要的，看完以后大家可能就明白评审专家意见里面的：“申请人没有排除其它可能性”是什么意思了。

研究团 队的通讯作者 是 Pier Paolo Pandolfi ，如果大家有印象应该还记得之前的一些报道：

这里我们就不讨论了。

下面我们主要看看这项研究：研究团队先前发现 Zbtb7a 基因编码的 Pokemon 蛋白 是 抑癌蛋白 ，而这项研究则发现 Zbtb7a 基因来源的 CircRNA circPOK 发挥癌基因 的作用，也就是说 circPOK 与其线性转录本 Pokemon 蛋白在肿瘤发生中发挥拮抗作用 。具体机制是 circPOK 结合 ILF2/ILF3 后促进 IL-6/VEGF 等因子的表达和肿瘤进展，即： circPOK 促进肿瘤进展的机制不依赖于 Pokemon 蛋白的。

当然，围绕上面这个发现研究团队做了很多支持的实验，比如：

“在 circPOK 表达的细胞中， Il6 和 Vegf RNAs 与 ILF2 的结合亲和力增加 ，表明 circPOK 可能增强了 ILF2/3 与这些 mRNAs 的结合能力。”；

“用 Actinomyosin-D 处理细胞以阻断转录 ，并在此背景下测量了 mRNAs IL6 和 Vegf 的稳定性。结果显示， circPOK 的存在增加了 IL6 和 VEGF mRNAs 的表达 ” ；

“通过 ChIRP 实验测定了内源性 circPOK 在 Il6 、 Vegf 和 Cxcl10 启动子区域的结合率 。结果显示 circPOK 能够结合到 Il6 的启动子区域，但与 Vegf 和 Cxcl10 的启动子区域结合较少 ”；

“使用 shRNAs 沉默了 MSCs 中 ILF2/3 的表达，并分析了这些 mRNAs 的表达变化。结果发现， 在没有 ILF2/3 的情况下，细胞因子 IL6 和 VEGF 的 mRNA 和蛋白质水平降低，但在 circPOK 存在时增加 。”

下面我们重点看“ 排除性证据 ”，也就是说上面这些实验是证明“ circPOK 结合 ILF2/ILF3 后促进 IL-6/VEGF 表达”的“ 支持性证据 ”，而研究团队也做了很多实验排除了其它的可能性。

我们看一下这部分的逻辑：

“在观察到 circPOK 作为间充质肿瘤中的原癌基因发挥功能作用后，我们接下来寻求确定这一作用背后的分子机制。 环状 RNA 在细胞质中富集，它们可以作为竞争性内源性 RNA （ ceRNAs ）对 miRNAs 进行海绵吸附，从而正面调节那些共享相同 miRNA 识别元件（ MREs ）的基因的表达…… 我们并未观察到过表达 circPOK-GTG 时 Pokemon 蛋白的表达水平有任何差异， 也没有发现 circPOK 对已知 Pokemon 蛋白靶标的表达产生影响。这反过来表明 circPOK 可能以 Pokemon 蛋白独立的方式发挥作用。 ” ——排除 miRNA sponge 调控 Pokemon 蛋白

“也有报道称环状 RNA 可以被翻译成蛋白质； circPOK ……一个大约 50 KDa 的蛋白，……然而 我们未能检测到任何预测大小或其他大小的额外多肽 ；此外，通过进行多聚体分离…… 我们未能在多聚体分数中检测到 circPOK ，这表明这种环状 RNA 不会被翻译 。因此，我们 排除了 circPOK 可以通过 Pokemon 蛋白在细胞质中发挥作用，或者它可以编码新的致癌蛋白的可能性，这也得到了以下事实的支持：一个没有 ATG 的 circPOK （ circPOK-GTG ）仍然保留了其原癌功能。 ” ——排除 circPOK 通过翻译为致癌蛋白发挥功能。

接下来就是 circPOK 通过 RNA 结合蛋白发挥作用了 ，也就是最后发现的 circPOK 结合 ILF2/ILF3 后促进 IL-6/VEGF 表达的机制，就不说了。