咖啡因调节糖皮质激素诱导的肺上皮细胞和成纤维细胞中CTGF的表达
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咖啡因和糖皮质激素经常用于治疗早产新生儿慢性肺部疾病,但潜在的相互作用在很大程度上是未知的。虽然糖皮质激素的抗炎作用是明确的,但它们对气道重塑的影响较少。
咖啡因已证实对气道炎症以及重塑具有积极作用。结缔组织生长因子(CTGF)在气道重塑中起关键作用,并且与早产儿诸如支气管肺发育不良等慢性肺疾病的发病机制有关。本文研究两者联用的作用机制。
糖皮质激素和咖啡因对H441和IMR-90细胞中CTGF mRNA表达的影响
单独使用各种糖皮质激素(地塞米松、布地奈德、倍他米松、泼尼松龙和氢化可的松)或者与咖啡因组合使用处理H441和IMR-90细胞。观察到H441和IMR-90细胞中的CTGF mRNA的显着诱导:
在H441细胞,糖皮质激素组CTGF mRNA表达水平显著升高,配合咖啡因组CTGF mRNA表达没有改变(Fig.1A);
在IMR-90细胞,糖皮质激素组CTGF mRNA表达水平显著升高,咖啡因并不诱导CTGF mRNA的表达,还显著降低了对照组IMR-90细胞中基础CTGF mRNA水平(Fig.1B)。
糖皮质激素和咖啡因对IMR-90细胞中CTGF蛋白表达的影响
在H441细胞中,没检测到CTGF蛋白;在IMR-90细胞中,用地塞米松(选择了糖皮质激素中一种)处理24小时后检测。
与对照相比,地塞米松处理后CTGF表达显著升高;
与对照相比,单独使用咖啡因,或者与地塞米松组合使用,IMR-90细胞中CTGF蛋白水平显著降低;与单独使用地塞米松相比,联合使用组CTGF蛋白水平降低。
表明,CTGF在肺上皮细胞和成纤维细胞中可由糖皮质激素诱导产生,而咖啡因可以预防这种诱导。
地塞米松和咖啡因对H441细胞中TGF-β1-3 mRNA表达的影响
为了鉴定咖啡因抑制糖皮质激素诱导CTGF的分子机制,检测H441细胞中TGF-β1-3(转化生长因子)的mRNA表达。
单独地塞米松、咖啡因,或者两者组合使用对TGF-β1的表达没有影响(Fig.3A);TGF-β2 mRNA地塞米松组稍微上调,而如果有咖啡因存在,则不会诱导TGF-β2改变(Fig.3B);
相比之下,单独使用地塞米松、单独使用咖啡因、两者组合使用均诱导TGF-β3的mRNA显著升高。与地塞米松组相比,咖啡因组TGF-β3的mRNA显著更高(Fig.3C)。
作者根据这个结果认为,地塞米松诱导了TGF-β2表达增加,咖啡因的抑制作用至少部分是通过TGF-β2的减少而不是TGF-β1。(TGF-β2有用)
cAMP、毛喉素forskolin、cilomilast、钌红对H441细胞CTGF mRNA表达的影响
为了检测咖啡因这种效果是不是通过PDE(磷酸二酯酶)实现的,进行了以下组处理H441细胞:
1、地塞米松和/或环磷酸腺苷
2、腺苷酸环化酶活化剂forskolin
3、PDE-4选择性抑制剂cilomilast,
并随后测量CTGF mRNA水平。
cAMP、地塞米松、cAMP&地塞米松处理H441细胞显著增加CTGF mRNA表达(Fig.4A);
forskolin、cilomilast单独处理H441细胞,和对照无差别;地塞米松与forskolin&地塞米松差在CTGF mRNA表达别不大,地塞米松与cilomilast&地塞米松在CTGF mRNA差别不大。因此,二者不能拮抗地塞米松对CTGF表达的刺激作用(Fig.4B-C)。
结果表明:咖啡因对糖皮质激素诱导的CTGF表达的抑制作用不是通过抑制PDEs来介导的。(作者查文献,先前有这方面的,来排除这条通路)
由于咖啡因可能激活H441细胞上的潜在雷诺定(ryanodine)受体释放Ca2+,添加雷诺定受体拮抗剂钌红进行实验,以抑制咖啡因的活化。实验显示添加钌红没用(原文未显示数据)。
在H441细胞中,地塞米松和咖啡因对TNF-α mRNA表达影响,以及TNF-α对CTGF mRNA表达的影响
已有报道证明,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)能抑制CTGF mRNA的表达。用地塞米松、咖啡因以及人类TNF-α和/或抗TNF-α抗体处理H441细胞。
TNF-α显著降低地塞米松诱导的CTGF mRNA增加,加入抗TNF-α抗体后拮抗该作用(Fig.5A);(据此推测TNF-α可能参与咖啡因调控的过程,并进行后续实验)
与对照相比,单独使用地塞米松TNF-α mRNA水平不改变。单独使用咖啡因、地塞米松&咖啡因联合使用,TNF-α mRNA水平显著升高(Fig.5B);
使用cAMP、cAMP与地塞米松组合处理,未观察到TNF-α mRNA有显著变化(Fig.5C)。表明,咖啡因非cAMP依赖性的诱导TNF-α表达增加、抑制CTGF表达。
因此,咖啡因拮抗糖皮质激素诱导的CTGF表达是通过非cAMP依赖性诱导的TNF-α。(原文绕口,TNF-α参与这个过程,但是参与的TNF-α不是从cAMP那条路来的)
咖啡因调节H441细胞中地塞米松引起的CTGF mRNA的表达与时间关系
分为对照、地塞米松组、咖啡因组、地塞米松组&咖啡因联用组,处理H441细胞(2h、4h、8h、12h、24h、48h六个点)。趋势如Fig.6A,咖啡因和地塞米松联用组12小时CTGF mRNA表达达到峰值,比单独使用地塞米松更明显;但随后在24h、48h下降,低于地塞米松单独使用组。48小时后,用咖啡因和地塞米松共同处理组的CTGF mRNA水平甚至低于对照细胞。(Fig.6A)
TNF-α mRNA表达趋势图,咖啡因和地塞米松共同处理组从12h开始走高,具有显著性。(Fig.6B)
大多试验,是在最初摸条件的时候做浓度梯度、时间点,来挑选出差异显著性最大的浓度、时间点(本文就是12h),以便后续试验容易有统计学意义。
Story路线
先挑刺,实验图太少,全是柱状图和折线图。有图才有真相,有图才可信,有图才能更好理解文章。各位小主儿,投稿时要注意有典型实验结果图的呈现。TGF-β这条线,实验略欠缺,总觉得有些不完善,应该做个缺失或者超表达看下。