新型质谱流式细胞术信号放大方法可实现低丰度蛋白质检测
哈佛大学的研究人员及其合作者开发了一种用于质谱流式细胞术的新型信号放大方法，有望在
单细胞水平上同时检测数十种稀有蛋白质靶标。
在最近的 Nature Biotechnology 研究中，该方法被称为
循环延伸扩增 （ACE）
，为研究人员提供了一种工具，可以解决悬浮或成像质谱流式细胞术以及可能更远的灵敏度挑战。
“质谱流式细胞术是一种非常通用的方法，但它存在灵敏度问题，”哈佛大学博士后研究员、该研究的主要作者之一 Xiao-Kang Lun 说。“将任何信号放大方法应用于质谱流式细胞术的需求确实很高。”
目前，质谱流式细胞术可以在单细胞水平上一次定量检测约 50 个蛋白质靶标。由于该技术通常需要数百种金属标记的抗体与每种类型的表位结合才能达到仪器的检测阈值，因此许多低丰度靶标仍未被检测到，在该研究的通讯作者 Peng Yin 实验室工作的 Lun 说。
此前，Yin 的团队开发了一种称为
免疫染色和交换反应信号放大 （Immuno-SABER） 的信号放大方法
，该方法部署了由所谓的引物交换反应 （PER） 产生的 DNA 条形码抗体和预合成的 DNA 连接体，以帮助增强低丰度蛋白质的信号。
虽然这种方法已被用于质谱流式细胞术成像，但用于悬浮质谱流式细胞术在技术上仍然具有挑战性，因为该方案中要求的严格洗涤条件不能轻易地用于悬浮细胞，Yin 实验室的博士后研究员、该研究的另一位主要作者 Kuanwei Sheng 说。
为了解决这个问题，哈佛大学团队开发了 ACE，这是一种信号放大策略，使用
基于热循环的 DNA 原位连接以及基于 3-氰基咔唑亚磷酰胺的 DNA 交联。
作为 ACE 工作流程的一部分，靶向蛋白质分析物的抗体首先与短 DNA 寡核苷酸引发剂偶联，随后应用于细胞悬液，用于细胞表面或细胞内标志物染色。
之后，将包含两个与起始序列互补的序列重复序列的延长寡核苷酸引入染色细胞，其中延长序列和起始序列杂交，起始链通过聚合酶延伸。在使起始剂-扩展剂对变性后，起始链经过多次热循环反应，在每个抗体偶联位点上产生数百个重复序列。然后，扩展的起始剂与数百个金属偶联检测器结合，从而显著增强抗体上下游的金属信号。
Lun 说，在质谱流式细胞术中应用 ACE 的一个挑战是，所涉及的热介导的单细胞液滴汽化步骤可以使 DNA 双链变性，解开金属偶联检测器和起始 DNA 之间的杂交，从而减弱扩增信号。
为了解决这个问题，该团队进一步在 ACE 中引入了光交联步骤。在检测器与起始剂杂交后，光交联剂被短紫外光激活，在检测器和起始剂 DNA 链之间形成共价键，防止它们分离。
根据他们的研究结果，哈佛大学的研究人员得出结论，ACE 可以帮助目标实现 500 倍以上的信号增加，同时保持“不折不扣的信噪比”。他们还验证了 33 个串扰可能性低的正交 ACE 引发剂，表明该方法的多重检测能力，同时确保这些引发剂序列中的大多数只能通过其相应的扩展器和检测器进行延伸和检测。
此外，研究人员表明，ACE 可以帮助分析小鼠细胞上皮-间充质转化 （EMT） 和反向间充质-上皮转化 （MET） 过程中的低丰度蛋白质组学标志物。此外，他们能够以单细胞分辨率分析人类 T 细胞中的 T 细胞受体 （TCR） 信号转导网络。
除了悬浮质谱流式细胞术之外，研究人员还将 ACE 应用于质谱流式细胞术成像，他们能够识别多囊人肾组织的组织隔室并分析病理状态，其中自发荧光限制了传统基于荧光的空间成像的使用。
Sheng 表示，该方法尚未达到其峰值多路复用能力，并且还有空间容纳更多目标。
MD 安德森癌症中心流式细胞术和细胞成像核心设施的联合主任 Jared Burks 说，该方法是传统质谱细胞术工作流程的“优雅转折”。
该研究的同行评审员 Burks 指出，ACE 方法的一个独特设计是将金属同位素探针拴在寡核苷酸上的紫外线交联步骤。此外，他还称赞该方法简化、易于使用，并且对现有的质谱流式细胞术工作流程增加的成本很小。
“我认为这种 [方法] 将非常令人兴奋，”Burks 说，他也是质谱流式细胞术平台制造商 Standard BioTools（前身为 Fluidigm）的顾问。“老实说，我预计这可能会在某个时候实现商业化，因为成本低且执行速度相对较快，”他指出。
据研究作者称，ACE 方案为 30 个靶标的常规质谱流式细胞术实验增加了约 24 美元的成本。Sheng 说，ACE 工作流程可以在两天内完成，除了试剂和热循环仪外，不需要复杂的实验设置。
哈佛大学的研究人员已经提交了与 ACE 方法相关的专利申请，Lun 表示，该团队有兴趣与公司交谈，以帮助将这项技术商业化。
尽管 ACE 做出了承诺，但该方法目前仍存在一些局限性。首先，Lun 说，这种化学技术是为了自动透化细胞而开发的，当研究人员只想对细胞表面标志物进行染色和研究时，这可能是一个问题。此外，ACE 的有效性取决于抗体的可用性及其对相应靶标的亲和力。此外，该团队正在尝试标准化抗体-寡核苷酸偶联方案，希望让可能不是该技术专家的研究人员更容易获得它。
