原名：
Transcriptomic and proteomic investigation of the ameliorative effect of total
polyphenolic glycoside extract on hepatic fibrosis in
Lamiophlomis rotata
Kudo via the AGE/RAGE pathway
译名：
转录组学和蛋白质组学研究揭示独一味总多酚苷提取物通过AGE/RAGE通路改善肝纤维化
期刊：
Journal of Ethnopharmacology
IF：
5.4
发表时间：
2024.1
通讯作者：
潘正
通讯作者单位：
重庆医科大学
在毒素诱导的肝纤维化恢复过程中，aHSC或肌成纤维细胞的命运已被揭示。大约50%的肌成纤维细胞逃避细胞凋亡，并在纤维化消退时作为不活跃的HSC留在肝脏中。失活HSC的存活与转录因子ETS1、GATA4、FOX-1、IRF2和PPARγ的上调以及AP1、CTCF、TEAD1、MEF2和NF-κB的下调有关。为了研究TPLR对HSC表型的影响，我们
使用TGF-β激活LX-2细胞，随后用TPLR处理（图1A）。药理学和遗传学研究表明，α
-SMA是活化HSC的特征标志物之一，其表达的desmin比qHSC和肝脏中的其他非实质细胞更多。我们证明，在用TGF-β处理的细胞中，α-SMA和desmin都被显著诱导，而这些蛋白质的表达在用TPLR处理后显著降低（图1B）。同样，蛋白质印迹分析显示，TGF-β处理后，α-SMA和desmin的蛋白质表达显著增加。尽管如此，在TPLR处理后，这些蛋白质的表达显著降低（图1C–E）。此外，qPCR证实，相应基因的转录水平与用TPLR孵育后观察到的蛋白质表达趋势一致（图1F–G）。随后，相关性分析显示，在TGF-β和TPLR刺激的条件下，α-SMA和Desmin的表达呈正相关（图1H）。此外，我们检测了ETS1、GATA4、FOX-1、IRF2、PPARγ、AP1、CTCF、TEAD1、MEF2和NF-κB转录因子的表达，这些转录因子在TGF-β和TPLR处理后调节星形胶质细胞的形态。TGF-β抑制ETS1、GATA4、FOX-1、IRF2和PPARγ的转录。这些分子的转录水平可以通过TPLR上调。相反，TGF-β诱导AP1、CTCF、TEAD1、MEF2和NF-κB的转录，并且这些分子的转录可以被TPLR下调（图1I）。所有结果表明，TPLR诱导aHSCS转化为iHSCs，从而抑制TGF-β诱导的LX-2细胞激活 。
图1
TPLR诱导活化的HSC转化为iHSC。
A、TGF-β诱导的qHSC转化为aHSC和TPLR处理的程序
表。B、 α-SMA和desmin的IF染色。C-E、α-SMA和desmin表达的蛋白质印迹分析。F
，
G、 α-SMA和desmin转录物的qPCR分析。H、α-SMA与desmin表达的相关性分析。I、 qPCR用于检测调节星形胶质细胞形态的转录因子。相对于对照组的统计学显著性，*P
2
.
转录组学和蛋白质组学显示
AGE/RAGE信号通路在TPLR
处理
后的HSC表型中至关重要
为了研究TPLR诱导aHSC转化为iHSC的机制，使用
RNA测序和蛋白质组学测定进行综合分析。
首先进行RNA-seq分析以鉴定差异表达的基因，随后使用堆叠图和维恩图对这些结果进行可视化。图2A和B表明 TPLR处理后的LX-2细胞中分别有449和815个DEG。在这些基因中，对照组和模型组有197个（61%）上调，124个（39%）下调。随后，对前10种不同的信号通路进行了KEGG通路分析，包括TNF、IL-17、AGE、TGFβ信号通路、NOD样受体、细胞因子-细胞因子受体和ECM受体相互作用（图2C）。已知这些信号通路参与对各种损伤的免疫反应，并作为损伤相关分子模式（DAMP）发挥作用。第三，在用TPLR处理
后，GSEA显示与损伤和肝纤维化的DAMP反应密切相关的IL-6/JAK/STAT3信号传导、炎症反应、上皮-间充质转化途径和TGFβ信号传导途径相关的基因表达减少（图2D–G）。
图2
与TPLR处理
后HSC表型相关的DEG的转录组学和蛋白质组学分析。
A、根据转录组学分析，饼图显示了TPLR处理后或未经TPLR处理的HSC基因数量的显著变化。B、火山图描绘了用TPLR或对照处理后与HSC表型相关的DEP。C、KEGG富集分析。前10个途径显著富集。蓝线图显示基因数量随时间变化显著。D-G、GSEA分析显示，TPLR降低了IL-6/JAK/STAT3信号传导、炎症反应、上皮-间质转化和TGFβ信号传导途径。H、蛋白质组学分析显示TPLR处理后或未经TPLR处理的HSC基因数量显著变化的饼图。I、火山图显示了TPLR治疗组和对照组之间的DEP。J、TPLR和对照组之间的DEP热图（红色，上调；蓝色，下调）。K、对DEPs
进行注释，将其分为三类，包括BP、CC和MF。L、气泡图显示KEGG途径富集分析，上述途径均显著富集，颜色由蓝色逐渐变为红色，表明P值逐渐降低。圆圈的大小意味着映射的蛋白质的数量。。
我们还进行了蛋白质组学测定以评估TPLR处理后的差异蛋白。共鉴定出50种和86种差异表达蛋白，其中对照组和治疗组分别有16种（16%）下调和35种（47%）上调（图2H–I）。使用热图和GO注释对这些蛋白质进行可视化。数十个基因被HSC中诱导的TGF-β上调，而被TPLR处理下调（图2J）。已鉴定的差异表达蛋白参与BPs，包括细胞过程、生物调节、代谢过程和发育过程的正调控（图2K）。CC分析显示，差异表达的蛋白质主要参与细胞解剖实体和含蛋白质复合物。在MF类别中，差异表达的蛋白质与结合和催化活性有关。最后，结合转录组数据，蛋白质组数据的KEGG通路分析显示，糖尿病并发症患者的AGE/RAGE信号通路发生了显著改变（图2L）。简而言之，组学结果表明，
AGE/RAGE信号通路在TPLR处理的HSC的形态学翻译中起着关键作用。
3. TPLR体外通过AGE/RAGE途径诱导aHSC转化为iHSC
RAGE最初被确定为AGEs的受体，由高血糖诱导并在糖尿病中积聚。早期的研究主要集中在RAGE与糖尿病的关系上。RAGE可以与多种配体结合，启动多种信号通路，包括PI3K/AKT/MAPK和JAK/STAT通路。这些信号级联激活各种转录因子，如NF-κB、AP-1和STAT3，促进促炎基因的表达以及细胞过程，包括迁移、增殖和凋亡（图3A）。为了研究TPLR是否通过AGE/RAGE途径促进aHSC向iHSC的翻译，我们
用在aHSC中过表达或敲低RAGE的重组慢病毒处理LX-2 细胞。
免疫荧光染色显示TPLR抑制RAGE的表达。过表达RAGE后，与TPLR组相比，RAGE和desmin的表达分别增加了2倍和1.7倍。相反，RAGE敲低进一步降低了RAGE和desmin的表达。与TPLR处理
组相比，RAGE敲低组的RAGE和
desmin表达分别低3/7和2/7（图3B–D）。随后，通过蛋白质印迹评估RAGE和下游蛋白的表达。TPLR降低了RAGE、RAS、p-P38、P105和P65的表达，而RAGE过表达的慢病毒诱导了它们的表达（图3E-J）。
图3 TPLR通过AGE/RAGE途径诱导aHSC转化为iHSC。A、HSC激活中AGE/RAGE通路的程序
表。B、RAGE和
desmin的IF染色。C-D，HSC中RAGE和desmin水平的定量。E-J，RAGE和下游蛋白表达的蛋白质印迹分析。K、 qPCR检测转录因子的表达。与TGF-β组相比具有统计学意义，*P
4. TPLR减
轻CCl
4
小鼠肝损伤的实验研究
为了确定
TPLR对肝损伤的影响，我们使用CCl
4
构建了肝纤维化小鼠模型（图4A）。
为了评估TPLR预防肝损伤和纤维化的疗效，我们将其与两种阳性对照药物秋水仙碱（P1）和FZHY制剂（P2）进行了比较。苏木精和伊红（H&E）、Masson和Sirius红染色用于检查不同TPLR剂量下的肝脏病理。结果表明，模型组肝细胞受损，结构紊乱，肝细胞样结节再生，组织中形成假小叶。肝窦、中央静脉和门静脉周围可见炎症细胞浸润。Masson染色显示CCl4组中存在显著的胶原沉积和严重的纤维化（图4B）。然而，用TPLR处理
后，这些病变显著减轻，如受损肝细胞、假小叶和胶原数量减少所示（图4B）。
此外，对TPLR、FZHY和秋水仙碱对肝损伤的影响的评估显示，秋水仙碱，其次是高剂量TPLR和FZHY胶囊，在消除肝纤维化方面表现出显著的疗效。此外，TPLR显著降低了ALT、AST和总胆红素（TBIL）的血液水平，这是肝功能的关键指标（图4C–E）。此外，TPLR显著降低了血液中TNFα和IL-6的水平，同时诱导了IL-10的表达，这是炎症的关键指标（图4F–H）。总之，这些结果表明，TPLR抑制了炎症因子的释放，并保护小鼠免受CCl
