铁死亡+分型+WGCNA，揭示头颈鳞状细胞癌中铁死亡相关抗原治疗潜力

Genes & Diseases 上发表的“Identification of ferroptosis-associated tumor antigens as the potential targets to prevent head and neck squamous cell carcinoma”揭示了 CAV1、FTH1和SLC3A2作为HNSC中铁死亡相关肿瘤抗原的潜在靶点，为开发针对FS2亚型HNSC患者的mRNA疫苗提供了理论依据。

方法

数据来源： 从UCSC Xena 数据库获取 GDC TCGA HNSC 队列数据；从GEO数据库获取包含基因表达数据和临床信息的GSE6585816 数据集并用R包limma 进行了标准化；从FerrDB 获取了424 个铁死亡相关基因；从过往文章获取免疫原性细胞死亡（ICD）和免疫检查点（ICP）基因。

基因表达分析： 利用GEPIA 和cBioPortal 工具进行基因表达差异分析和遗传改变比较分析。

免疫细胞浸润分析： 使用ImmuCellAI 评估免疫细胞丰度，并用ESTIMATE 网站计算免疫评分。

铁死亡亚型识别： 通过R包ConsensusClusterPlus 对铁死亡相关基因进行聚类分析，以确定不同的铁死亡亚型。

预后评估： 使用对数秩检验和ANOVA 评估铁死亡亚型的预后价值，并用卡方检验筛选突变基因；使用GSVA包的ssGSEA 分析计算每个样本的免疫富集评分。

基因共表达网络分析： 利用R包WGCNA 构建免疫相关基因的共表达网络，并进行功能富集分析。

肿瘤微环境分析： 使用Monocle包进行降维分析，构建HNSC中铁死亡亚型的肿瘤微环境景观。

结果

目的： 识别HNSC中潜在的与铁死亡相关的肿瘤抗原。

结果：

1. 通过筛查，确定了2138个差异表达的基因，其中1532个能够编码肿瘤相关抗原（图1A）；

2. 通过分析单个样本中的突变基因片段和突变数，鉴定出15855个可能编码肿瘤特异性抗原的突变基因（图1B，C）；

3. 突变分析表明，TP53的突变基因组片段和突变计数频率最高（图1D，E）；

4. 使用遗传突变和基因过表达数据，确定了1160个频繁突变和上调的癌症相关基因，这些基因可能作为肿瘤抗原；

5. 通过生存分析和抗原呈递细胞的相关性分析，从1160个潜在抗原中筛选出三个与铁死亡相关基因——CAV1、FTH1和SLC3A2，并且它们与不良预后相关；

6. Western blot和创伤愈合实验结果表明，这些抗原表达的降低与HN6细胞的迁移能力增强相关联；

7. ImmuCellAI分析显示，这些抗原与树突状细胞和巨噬细胞表达呈正相关。

图1

目的： 识别HNSC中潜在的铁死亡亚型，并探索这些亚型的临床意义。

结果：

1. 通过对TCGA-HNSC中424个铁死亡相关基因进行聚类分析，成功将HNSC患者分为FS1和FS2两个铁死亡亚型（图2A-C）；

2. PCA分析显示这两个亚型在主要组分分析中表现出高度多样性，表明它们在分类上的潜在应用价值（图2D）；

3. Kaplan-Meier生存分析显示FS2亚型的预后较FS1亚型差（图2E）；

4. FS1亚型主要在早期患者中观察到，而FS2亚型在中晚期患者中更为普遍（图2F）；

5. 在GSE65858队列中验证了这两个铁死亡亚型的存在，并且在该队列中也发现了与TCGA-HNSC队列相似的预后差异（图2G-I）。

图2

目的： 探究HNSC中铁死亡亚型与肿瘤突变状态之间的关联。

结果：

1. 使用TCGA-HNSC突变数据集计算每位HNSC患者的肿瘤突变负荷（TMB）、微卫星不稳定性（MSI）和总突变数，并比较两种亚型；

2. 在两个铁死亡亚型之间没有观察到总突变数和突变负荷的显著差异（图3A，B）；

3. FS2亚型相比FS1亚型表现出更高的MSI（图3C）；

4. 在不同亚型中发现了30个基因（TP53, TTN, FAT1, CDKN2A等）的突变状态存在差异（图3D）；

5. 这些结果表明MSI可能作为应用mRNA疫苗的潜在指标。

图3

目的： 探究HNSC铁死亡亚型与免疫调节因子之间的关系，特别是ICD调节基因和ICP的表达模式。

结果：

1. 在TCGA-HNSC队列中发现了25个ICD基因，其中17个表现出差异表达（图4A）；

2. 在GSE65858队列中发现了23个ICD基因，其中13个表现出差异表达（图4B）；

3. 在两个数据集中，多个ICD基因（如ANXA1, CALR等）的表达趋势一致，表明这些基因可能在HNSC中铁死亡亚型中起重要作用；

4. 在TCGA-HNSC和GSE65858队列中分别识别了46个和42个ICP基因，并且大多数ICP在两个数据库中的表达相似，FS2亚型中的表达水平高于FS1亚型（图4C，D）；

5. 因此铁死亡表型可通过反映ICD和ICP表达水平，作为mRNA疫苗的潜在生物标志物。

图4

目的： 探究HNSC中FS1和FS2的细胞和分子特征，并了解它们与免疫细胞浸润之间的关系。

结果：

1. 在TCGA-HNSC和GSE65858数据中，使用ssGSEA评估了28个已报道特征基因的富集得分，并用热图展示免疫细胞组成（图5A，B）；

2. 在22种免疫细胞类型中，高细胞得分表明预后较好（图5C-E）；

3. TCGA-HNSC和 GSE65858数据集均显示嗜酸粒细胞、未成熟B细胞和17型T辅助细胞的表达存在差异（图5F-K）；

4. 在TCGA-HNSC和GSE65858数据集中，FS2亚型患者的免疫细胞浸润水平较低，FS1的肿瘤纯度和基质评分较高；

5. 因此，FS1亚型具有“热”免疫表型，而FS2亚型则表现为“冷”免疫表型。

图5

目的： 通过铁死亡相关基因的表达谱来描绘HNSC的异质性，并探索不同铁死亡亚型在个体患者中的分布情况。

结果：

1. 应用Monocle对患者的免疫基因表达谱进行降维处理，生成HNSC铁死亡景观（图6A）；

2. 主成分分析显示，第一主成分（PCA1）和第二主成分（PCA2）与多种免疫细胞的浸润呈正相关（图6B）；

3. 样本存在显著的内部异质性，研究根据样本聚类的位置将样本划分为七个不同的状态（图6C）

4. 不同状态在各种铁死亡亚型中的分布比例不同，且这些状态的患者在总体生存上存在显著差异（图6D，E）

5. 这些结果表明铁死亡亚型可以有效地预测HNSC患者的早期免疫状态和预后。

图6

目的： 识别HNSC中的免疫中心基因和免疫基因共表达模块，挖掘潜在靶点。

结果：

1. 对免疫相关基因进行了WGCNA分析，软阈值设置为4，每个模块最低基因数为10，最终获得四个模块，灰色模块表示未分配的基因（图7A-D）；

2. 在各个模块中，FS2的特征基因评分均低于FS1，表明 FS2与免疫冷状态之间存在关联（图7E）；

3. 预后相关性分析显示蓝色模块与HNSC预后显著相关性（图7F）；

4. 根据蓝色模块评分的预后分析，相比低分组，高蓝色模块得分组有更好的预后（图7G）；

5. 蓝色模块中的基因在免疫相关途径和功能中富集，如细胞因子-细胞因子受体相互作用、炎症反应、正向免疫反应调控和白细胞激活调控（图7H，I）；

6. 在蓝色模块中识别出了枢纽基因IL32、FCGR2B和CD1C，可作为潜在预后标志物和治疗靶点。

图7

结论