2024年11月20日，第十二届慕尼黑上海分析生化展（Analytica China 2024）在上海成功闭幕。作为分析、生化技术、诊断和实验室技术领域的科技盛会，它汇聚了来自23个国家和地区的1200多家参展企业及合作单位，塞纳生物等国内测序公司也参展其中。本次大会还特别设立了“临床研究与诊断”和“生物技术与研究服务” 两大专题，从产、学、研、结合临床等多维度，全面展示了行业内的创新技术和产品。今天，小编就与大家一同走进微析世界，盘点塞纳生物的核心技术。
1977年，Frederick Sanger提出了双脱氧终止法（Sanger）测序技术，拉开了基因组学时代的帷幕【1】。1990到2003年，美、英、法、德、日和我国科学家们共同参与了预算达 30 亿美元、堪称生命科学领域的“登月计划”的人类基因组计划（The Human Genome Project）【2】，旨在测定组成人类染色体中所包含的30亿个碱基对组成的核苷酸序列，通过绘制人类基因组图谱，达到破译人类遗传信息的最终目的。
2015年，毕业于北京大学的陈子天博士联合谢晓亮院士、黄岩谊教授团队创立了赛纳生物。在一次采访中，陈子天博士强调“赛纳生物的目标就是基于全自主研发的国产测序平台，构建中国主导的测序新生态”。一路稳步发展到今天，在第10个年头，公司仍秉承着“通过技术拓展知识边界”的企业愿景，不断精雕细琢，打造自主、优质、开放的基因测序平台。
稳步发展到第十个年头的塞纳生物，不仅打破了曾经仅由外资企业垄断的测序市场状态，而且与其他国内测序企业携手构建了由中国主导的测序新生态。
2011年6月：谢晓亮院士及其科研团队在Nature Methods（IF 47.99）提出FLUOROGENIC荧光发生测序化学技术（图1）【3】。该技术解决了不稳定光信号的技术痛点，结合了当时两大主流测序技术的优点，最终实现了测序的高精确度和短循环周期（详见本文第三部分“核心技术”第一点的详细介绍）;
2015年4月：塞纳生物成立，总部坐落于北京亦庄经济开发区;
2017年12月：在此前谢晓亮院士首创的荧光发生测序技术基础上，黄岩谊教授、陈子天博士等人提出了新的测序策略-ECC（error-correction code）纠错码技术。该成果在线发表在Nature Biotechnology（IF 68.164）上（图2）【4】（详见本文第三部分“核心技术”第二点的详细介绍）;
2022年6月：S100基因测序仪获欧盟CE-IVDR认证；
2024年2月：S100基因测序仪获批国家药品监督管理局（NMPA）医疗器械注册证（国械注准20243220383）。
图 1荧光发生测序化学技术在Nature Methods（IF 47.99）发表
图 2 ECC纠错码技术在Nature Biotechnology（IF 68.164）发表1.FLUOROGENIC荧光发生测序化学技术
在2011年谢晓亮院士及其科研团队提出FLUOROGENIC技术之前，当时的基因测序技术主要有两个方向：“焦磷酸测序（pyrosequencing techniques）”和“基于荧光的测序（Fluorescence-based methods）”。两者各有优缺点：前者焦磷酸测序是边合成DNA边实现测序（SBS，sequencing-by-synthesis），优点为天然DNA合成，不需要化学去除步骤，但不足的是光信号不稳定，即，当加入新三磷酸核苷酸时，荧光素酶水解三磷酸键产生能量，这种能量以光的形式发出，光信号转瞬即逝，需要极灵敏的检测系统捕捉这一瞬间的光信号。这种技术当时的主要代表测序仪是罗氏的454 Genome Sequencer。后者荧光检测（主要代表测序仪Illumina的HiSeq 2000）是基于荧光的测序，优点是可以产生稳定的光信号，但不足是需要很多额外的化学修饰步骤才能产生荧光【5】。
谢晓亮院士及其科研团队提出的FLUOROGENIC荧光发生测序化学技术，兼顾了焦磷酸测序的简单流程和荧光检测的稳定信号，实现了测序的高精确度和短循环周期（图3）。
图 3 FLUOROGENIC荧光发生测序化学技术（来源：塞纳生物官网）2011年发表在Nature Methods（IF 47.99）上的文章详细介绍了该测序技术【3】。通过DNA聚合酶将非荧光的末端磷酸盐标记的荧光核苷酸（terminal-phosphate labeled fluorogenic nucleotides，TPLFN）并入DNA引物/模板中，释放出标记的非荧光多磷酸，这些非荧光多磷酸被磷酸酶水解后，生成荧光产物（图4a）。图4b 绘制了TPLFN（虚线）和荧光产物（实线）的吸收（蓝色）和发射（绿色）光谱。图4c 展示了工作流程，即：①DNA在PDMS（polydimethylsiloxane，聚二甲硅氧烷）微反应器中被固定在微球上，微反应器中装载有反应混合物，混合物含有DNA聚合酶、磷酸酶和四种TPLFNs中的一种，②它们在低温、密封和加热下触发引物延伸。③在含有DNA模板的微反应器中产生荧光团。④用荧光显微镜成像，解除密封，并在下次操作前清洗。整个SBS过程可以实现在DNA互补链合成时，释放同所延伸核苷酸数目相等的荧光分子，进而达到低错误率。
图 4 荧光焦磷酸测序化学和工作流程（来源：公开发表文献【3】）
接下来，我们了解下硬件模块。测序系统包括三个模块：成像，流体和温度控制（图5）。
①成像模块是一个单色荧光显微镜，由激光器、卤素灯、CCD相机、显微镜框架、滤光片组和一个带有一些附加光学元件（相位扰频器和顶帽扩散器）的20倍物镜组成。
②流体模块是由旋转选择阀、液压和气动阀、氮气管线和真空管线组成，流体模块可以控制密封、试剂流动和洗涤。流体模块中的真空管线既用于将试剂输送到样品中，也用于密封PDMS微反应器。
③热电温度控制器在试剂装入反应器中时，先冷却微反应器，以避免在密封之前大量过多的核苷酸掺入。密封后，温度控制器模块加热微反应器，以实现引物的快速扩展。
图5荧光焦磷酸测序系统示意图（来源：公开发表文献【3】）
最终检验阶段，研究团队首先对“homopolymer ladder（HL，均聚物阶梯）”寡核苷酸进行了测序。之所以首先选择HL寡核苷酸，是因为在理想情况下，信号与均聚物的核苷酸长度是成正比的。结果显示，该测序技术的单读原始精度达到了99%，其中80%的HL测序轨迹是无错误的，可从图6中的黑点直观地看出。此外，所有测序周期数据汇总的信号分布直方图显示，对应于0、1、2、3、4和5个碱基的信号水平，其分离程度很好（图6，右）。
图 6荧光焦磷酸测序图像和信号线性演示（来源：公开发表文献【3】）
为了在任意序列上测试这种测序方法，研究团队还设计了三个准随机DNA模板，这些模板的序列特征具有相当大程度的不同。三个寡核苷酸的测序轨迹如图7a-c。研究团队还对这三个随机寡核苷酸测序的所有36个测序结果，做了汇总分析（图7d）。结果表明，该测序技术在30个碱基的读取长度上保持了至少99%的平均单次读取原始精度，即错误率为1%或更低。
图 7 准随机序列的测序轨迹及全局误差分析（来源：公开发表文献【3】）
2. ECC纠错编码测序技术
ECC“编码+解码”策略，其实概念上并不新鲜，在通讯和存储领域已经有近半个世纪的应用——被有效用来探测和纠正错误。黄岩谊教授、陈子天博士等科研人员整合了多学科力量，耗时7年，最终将ECC策略成功应用于生命科学领域的测序技术中来，提高了测序精度，延长了测序读长。
黄岩谊教授团队新发展了“对偶碱基（dual-base）荧光发生”SBS测序流程【4】。这个流程主要通过对测序试剂按对偶碱基分为三组，这三组由两两匹配而成。然后，对待测DNA序列进行三轮独立测序，产生的三条互相正交的简并序列编码可以互为校验。该流程不仅能够通过解码推导出真实碱基序列信息，而且对单轮测序错误位点也具备校正能力（图8）。
图 8 ECC纠错编码测序技术（来源：塞纳生物官网）
举一个简化的测序错误纠正的例子（图9）。在“位置5”处检测到第一个错误的码字（codeword），并且有三个可能的错误源。在这种情况下，可以从第6位左移来识别和纠正插入错误（insertion error）。同样，在“位置14”处的第二个缺失错误可通过从第14位右移来识别和纠正缺失错误（deletion error）。经过这两次修正后，所有码字都是正确的，并且获得了一个无错误的序列。
图 9 测序纠错举例（来源：公开发表文献【4】）
解码算法是三维立体和动态的（图10）。该科研小组以3位字符串为轴，构建了三维码字空间。每个位点代表一个3位的码字，根据奇偶校验可分为通过（pass）或错误（error）。从位点（1,1,1）开始，当且仅通过Pass校验后的路径方可表示可能的解码DNA序列。科研小组使用动态编程贯穿码字空间，用贝叶斯公式为每条路径分配一个概率。将概率最大的路径往回追溯，确认为已解码的DNA序列。
图 10 三维解码算法（来源：公开发表文献【4】）
最后，在实验室搭建的原理样机上，科研小组获得了单端测序读长250碱基的测试结果，提升了当时的测序读长能力。并且还获得了200碱基读长无错误的实验结果（图11右（d）），大幅度增加了测序精度。图11左（c）是ECC应用前的错误率。
图 11 ECC应用前后的错误率（来源：公开发表文献【4】）
3.BITSEQ简并测序技术
该技术是上面提到的ECC纠错编码测序技术中的重要一环。在荧光SBS反应中，两种碱基在一个反应循环中被混合引入（图12）。一个聚合酶与一个DNA模板（黑色）结合，引物（灰色）有效延伸，重组成双链形式，留下3'-羟基端。对偶碱基的混合允许任何互补的碱基被添加到合成链（彩色）的3'-羟基端，然后释放同所延伸核苷酸数目相等的荧光团分子。
图 12 BITSEQ简并测序技术（来源：公开发表文献【4】）
4.独特的两相流技术
两相流技术构造有机相/水相重复的密封体系，这种生物芯片能精确控制反应开合，提高关键试剂的利用率。
图 13独特的两相流技术（来源：塞纳生物官网）
S100测序仪（图14）打破了外资垄断的行业壁垒，基于赛纳生物的“一步法测序化学、两相流生物芯片、三位编码系统”的核心技术设计开发，实现了设备、试剂、芯片、算法全套国产自主解决方案，且专利覆盖。
图 14 桌面型测序仪S100
近年来，测序技术已在肿瘤诊疗、感染防控、生殖健康等领域被积极并逐步深入应用。精准检测是临床诊治的关键，尤其在肿瘤领域，不同驱动基因的阳性与否，涉及后续截然不同的治疗思路和策略。如果能够实现三早，即“早筛查、早诊断、早治疗”，那么，患者的长期生存率和临床结局或将可能被改写。这些诊疗提升，离不开先进的检测技术来识别肿瘤的早期信号。因此，兼具深度和精准度的测序工具，尤为关键。另外，准确可靠的检测结果，对科研也是助力，以防弯路和误导。
综上，在技术和资本高度壁垒的测序行业中，塞纳生物已经突破了技术难关，提供了准确、简便、快速的上游解决方案，实现了自主可控的技术创新。我们期待更多国内测序企业带来卓越的技术和产品，助力科学研究，解决临床难题，护航人民健康。
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参考文献
【1】. Sanger F, et al. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 Dec;74(12):5463-7.
【2】. Moraes F, Góes A. A decade of human genome project conclusion: Scientific diffusion about our genome knowledge. Biochem Mol Biol Educ. 2016 May 6;44(3):215-23.
【3】. Sims PA, et al. Fluorogenic DNA sequencing in PDMS microreactors. Nat Methods. 2011 Jun 12;8(7):575-80.
【4】. Chen Z, et al. Highly accurate fluorogenic DNA sequencing with information theory-based error correction. Nat Biotechnol. 2017 Dec;35(12):1170-1178.
【5】. Baker M. et al. Xiaoliang Sunney Xie. Nat Methods 8, 523 (2011).
