Plus深读 | R-2HG通过靶向FTO \/ m6A \/ MYC \/ CEBPA信号发挥抗肿瘤活性

在之前的研究中，作者已经介绍了FTO和m6A之间的联系。而在这篇研究中，作者继续深入研究FTO和m6A上下游的分子调控机制。向下研究m6A影响了哪些转录本：由于m6A是一种表观遗传变化，可以发生在肿瘤关键基因的转录本上；在这里，作者聚焦在MYC / CEBPA这个通路的基因上。向上可联系其他通路或蛋白：由于FTO是脂肪代谢相关的蛋白，可以深入探讨代谢对FTO的作用。这里作者选取了R-2-羟基戊二酸（R-2HG），这可由IDH1 / 2突变产生的代谢物质。而IDH1 / 2突变在白血病和胶质瘤中较为常见。所以，整个过程就是IDH1 / 2突变造成R-2HG增多，R-2HG增多抑制了FTO，FTO降低造成MYC / CEBPA转录本m6A修饰。在以往的研究和认知中，R-2HG是和肿瘤发生存在密切关系的。但在这篇研究中，作者发现R-2HG造成的m6A，从而抑制肿瘤生长。

在白血病中R-2HG能抑制肿瘤生长

作者首先将27种人白血病细胞系暴露于一系列浓度的R-2HG中。出人意料的是，R-2HG在大多数这些白血病细胞系中以时间和剂量依赖性方式抑制细胞增殖和活力（图1A和1B）。

R-2HG显著抑制体内敏感性AMLs的进展

作者接下来使用异种移植白血病模型来评估R-2HG对体内白血病进展的影响。用免疫缺陷NSGS和NRGS小鼠进行R-2HG治疗，包括直接R-2HG注射和由IDH1R132H-介导产生R-2HG。用R-2HG进行的体内治疗显著抑制了敏感细胞异种移植小鼠的基本进展并延长存活，但在具有耐药细胞的那些小鼠中不存在这样的情况（图1C和1D）。由IDH1R132H产生的内源性R-2HG也显著抑制敏感性AML小鼠中疾病进展并增加存活（图1G）。外源性（体内注射）和内源性（IDH1R132H产生的）R-2HG在2HG-敏感AML细胞小鼠中产生较弱的白血病症状（图1E和1H-1K）。 R-2HG治疗来自具有这些敏感细胞的NSGS和NRGS小鼠的AML原始细胞显著减少，但是与2HG抵抗的AML细胞不同（图1L）。因此，作者的体内结果表明R-2HG可能具有治疗R-2HG敏感AML的治疗潜力。

与白血病细胞R-2HG敏感性有关的因素

为了确定与白血病细胞中R-2HG敏感性相关的潜在因素，作者用四种（R-2HG）敏感和五种抗性白血病细胞系以及四种健康对照样品进行了RNA测序（RNA-seq）（图2a）。发现一组Fe（II）/ a-KG-依赖性双加氧酶在敏感性AML细胞中显著高于抗性AML细胞或正常对照（图2A）。该结果在qRTPCR中也得到了证实（图2A，2B）。然而，与所有三种类型的正常对照细胞相比，仅白血病样品中FTO的表达水平显著更高（图2B）。

作者接下来在R-2HG处理后用NOMO-1和MA9.3ITD细胞进行RNA-seq（图2C）。通过基因组富集分析（GSEA），作者通过两组RNA-seq数据集（图2A，2C，2D）鉴定了7个与R-2HG敏感性强相关的基因组。在这些途径中，相对于正常对照，在R-2HG-抗性白血病样品中MYC，G2M和E2F信号传导途径被高度激活，而在R-2HG-敏感样品中仅被中度激活（图2E，2F），表明它们的过度激活可能是造成耐药性白血病细胞对R-2HG抗性的原因。R-2HG抑制了R-2HG敏感的AML细胞中MYC，G2M和E2F信号通路的活性（图2C-2E）。MYC，G2M和E2F信号协同调节G0 / G1，G1 / S和G2 / M细胞周期转变可能是R-2HG在敏感细胞中引起细胞周期停滞和凋亡的主要机制。

R-2HG靶向敏感性白血病细胞中的FTO

FTO是第一个鉴定的RNA脱甲基酶，是一种Fe（II）/α-KG依赖性双加氧酶，催化RNA中m6A甲基化的去甲基化并在AML中起着致癌作用。由于FTO的过表达和其在白血病细胞中的表达水平与R-2HG敏感性之间的正相关性（图2B），作者试图确定FTO是否是R-2HG的关键真正靶标。作者发现R-2HG处理显著增加了敏感细胞中全m6A的丰度，但是在耐药细胞中没有发生（图3A和3B）。因此，作者的数据表明R-2HG可能抑制FTO活性，从而提高敏感AML细胞中的m6A RNA修饰。

为了确定FTO是否是R-2HG的直接靶标，作者进行了三种类型的实验。进行药物亲和响应靶标稳定性（DARTS）测定和细胞热漂移测定（CETSAs）以证明FTO蛋白和R-2HG之间的直接结合，而进行体外FTO去甲基化活性测定以验证R-2HG竞争性抑制FTO在无细胞系统中的酶活性。作者的DARTS数据表明R-2HG与FTO结合，以剂量依赖性方式保护其免受蛋白酶降解（图3E）。在存在R-2HG的情况下，CETSA检测到FTO解链曲线的明显变化，表明细胞内FTO和R-2HG之间的直接结合（图3F）。体外FTO活性分析证实R-2HG可抑制FTO脱甲基酶活性（图3G-3I）。最后， shRNA敲低内源性FTO同样显示出R-2HG抑制细胞活力和增加细胞poly（A）+ RNA全m6A水平的作用（图3J， 3K）。相反，增加表达野生型FTO而不是突变型FTO显著促进细胞增殖并降低总m6A水平（图3J，3K）。此外，R-2HG敏感的白血病细胞中FTO的敲低显著降低了它们对R-2HG的敏感性（图3L）。总的来说，作者的数据证明FTO是R-2HG的直接靶点，也是R-2HG诱导白血病细胞生长抑制效应的主要介质。

R-2HGxFTOxm6A轴调节MYC表达

为了鉴定负责生长抑制的R-2HGxFTOxm6A轴的关键下游靶点，作者用R-2HG和PBS处理的NOMO-1细胞进行了转录组范围的m6A测序（m6A-seq）和RNA-seq。在R-2HG处理显著变化的6024个m6A峰中，绝大多数（5281; 87.7％）显示出m6A丰度的显著（p <0.01）增加（图4A和4B）。 m6A水平升高的转录物（m6A-hyper）也显著富集在MYC，E2F和G2M信号通路的靶基因上（图4C）。

作者的m6A-seq数据显示，MYC转录物富含m6A峰，其通过R-2HG处理后显著增加，特别是在50UTR和CDS区（图4D）。这个结果在基因特异性m6A qPCR得到证实（图4E）。相对于对照，野生型FTO而非突变型FTO的过表达显著增加携带野生型MYC 50UTR或CDS的报道载体的萤光素酶活性（图4F）。作者的基因特异性m6A qPCR结果显示具有野生型m6A基序的载体含有比具有突变型m6A位点的m6A高得多，并且过表达野生型FTO后显著减少m6A丰度（图4G）。此外，携带（m6）A-T突变体50UTR或CDS的报道载体转录的RNA比细胞中野生型载体转录的RNA更丰富（图4H），可能因为前者由于缺乏m6A修饰而更稳定。总之，作者的数据表明，FTO可以通过m6A依赖性机制增加MYC的转录水平。

R-2HG显著降低了敏感细胞中MYC mRNA的稳定性，但在抵抗细胞中却没有（图4I），表明R-2HG诱导的敏感细胞中MYC下调可能与MYC转录物的稳定性降低有关。作者的数据表明，由FTO或R-2HG引起的m6A变化可能通过影响MYC转录物的稳定性，可能通过YTHDF2相关机制影响MYC表达。

作者还进行了M6A-seq的R-2HG和PBS处理的敏感细胞（MA9.3ITD），有或没有FTO敲低和抗性细胞（MA9.3RAS），有或没有FTO过表达以进一步分析R-2HG和FTO对MYC转录本的m6A修饰（图4K和4L）。在MA9.3ITD细胞中，R-2HG增加了MYC转录物的50UTR和CDS区域中m6A的丰度，并且这种增加被FTO敲除（图4M和4N）而抵消。相比之下，R-2HG对亲本MA9.3RAS细胞中MYC转录物的m6A丰度没有显示出明显影响，但是在FTO-过表达MA9.3RAS细胞中显著增加了MYC转录物的50UTR和CDS区域中的m6A丰度（图4M和4N ）。敲低MYC后能降低敏感细胞对R-2HG的反应（图40），表明MYC是R-2HGxFTOxm6A轴的重要靶标。因此，作者的数据进一步表明，FTO及其下游靶标（例如，MYC，ASB2和RARA）是R-2HG在敏感性白血病细胞中的主要效应物。

通过R-2HGxFTOxm6A轴抑制CEBPA抑制FTO转录

作者还发现延长R-2HG处理（例如96小时）可以显著降低敏感性白血病细胞中的FTO蛋白水平，但在耐药细胞中没有发生这种情况（图5A）。R-2HG处理48小时显示出对FTO蛋白水平的较小影响，但poly（A）+ RNA中的全m6A丰度明显增加（图5B），

这意味着延长的R-2HG处理后抑制FTO表达可能是m6A丰度增加的结果。延长R-2HG处理介导的FTO下调可能归因于转录抑制（图5C）。为了鉴定可能调节FTO转录的转录因子（TF），作者分析了FTO和92个TF基因之间在四种AML数据集中在FTO基因的“核心启动子”中具有推定结合位点的表达之间的相关性（图5D ）。其中，CEBPA，MZF1，NFATC3和RFX3显示正相关（p <0.05），而NFKB2和TFEB在所有四个数据集中呈现负相关（p <0.05）（图5E）。在4个正相关的TF中，只有CEBPA显示出在敏感细胞中R-2HG处理后m6A修饰增加和表达降低（图5F和5G）。

与R-2HG介导的效应一致，CEBPA的表达也可以通过过表达FTO并通过FTO敲低来实现（图5H和5I）。通过YTHDF2可以识别R-2HG处理后CEBPA mRNA增加的m6A修饰，导致CEBPA转录物稳定性降低和表达降低（图5J和5K）。此外，CEBPA在AML患者中异常上调（图5L），其强制表达促进了FTO启动子的转录活性（图5M）。在R-2HG敏感的白血病细胞中，敲低CEBPA减少细胞生长，减少FTO丰度，并大部分消除R-2HG诱导的生长抑制效应（图5N-5P）。总之，R-2HGxFTOxm6A轴抑制CEBPA，作为一种反馈机制可以进一步抑制FTO转录（图5Q）。

异位IDH1突变体和S-2HG都对R-2HG产生类似作用

为了确定突变体IDH是否可以模仿作者在R-2HG处理的细胞中观察到的表型，作者创建了具有诱导型突变IDH表达的白血病细胞系。诱导的IDH1R132H表达能模拟由外源R-2HG引起的表型，诸如抑制FTO和MYC表达，增强的m6A修饰，诱导的细胞周期停滞，减少的细胞增殖以及增加的细胞凋亡（图6A-6C）。细胞内R-2HG的测定证实IDH1R132H产生R-2HG至由300mM R-2HG处理产生的水平（图6B）。

S-2HG是R-2HG的对映体，它在结构和化学上与α-KG和R-2HG相关（图6D）。作者发现S-2HG在R-2HG敏感细胞中显示出生长抑制效应，但在R-2HG抵抗细胞中则没有（图6E）。 S-2HG也直接抑制FTO的去甲基化活性（图6F，6G）。 IDH突变和S-2HG一起可以在很大程度上模拟R-2HG的作用，包括直接抑制FTO，增加的全m6A修饰以及降低的白血病细胞增殖/活力。

FTO / MYC稳态控制R-2HG灵敏度

因为异位表达的IDH突变体（例如IDH1R132H）显示出抗肿瘤作用，为什么它们仍然存在于10％-20％的AML病例中？为了解决这个问题，作者使用图2A所示的RNA-seq数据对TCGA AML微阵列数据集进行了综合分析。作者鉴定了IDH突变型AML样品（相对于IDH-野生型AML样品，在整个集合或正常核型子集中）富集的5个核心信号传导途径，以及R-2HG抗性白血病细胞（相对到R-2HG敏感细胞）和R-2HG敏感性细胞（与健康对照相比）（图7A）。具有IDH突变的原发性AML细胞对JQ1（一种MYC信号传导抑制剂）也敏感，IC50低于1 mM，但IC50高于野生型IDH的AML细胞（图7B），可能是由于前者中MYC信号传导的过度激活。作者还证实，与IDH野生型AML样品相比，IDH突变AML样品具有更高的MYC及其关键靶标（例如CDK4和CDK6）表达水平和更低水平的FTO（但不是ALKBH5）表达（图7C）。Western blot显示R-2HG抗性白血病细胞系比敏感细胞系具有更高水平的MYC和更低水平的FTO; R-2HG处理导致敏感细胞中FTO和MYC表达显著降低，但对抗性细胞的影响最小（图7D）。

因此，作者认为高度活化的MYC信号传导可以降低R-2HG在大多数IDH突变AML细胞中的抗白血病作用。在抗性细胞中，诱导MYC敲低和JQ1介导的MYC抑制都可以增加它们对外源R-2HG和IDH1R132H的敏感性（图7E）。在敏感细胞中，MYC的过表达确实使得白血病细胞对R-2HG或IDH1R132H具有抗性并挽救R-2HG或IDH1R132H诱导的增殖抑制（图7F）。

R-2HG和化疗药物之间的协同作用也在体内得到验证。 R-2HG加柔红霉素或地西他滨的组合治疗在用R-2HG敏感的白血病细胞异种移植的白血病小鼠模型中显示出更好的治疗效果（图7G和图7E）。

总之，作者的数据表明高丰度的FTO赋予白血病细胞R-2HG敏感性，而MYC相关通路的超活化使白血病细胞（包括具有内源性IDH突变的细胞）对R-2HG具有抗性（图7H）。此外，R-2HG与一线化疗药物及其组合在临床上对治疗白血病具有显著的协同抗肿瘤作用。

总结

虽然累积的代谢物R-2-羟基戊二酸（R-2HG）导致肿瘤发生，但它可以通过增加全N6-甲基腺苷（m6A）RNA修饰在肿瘤亚群中也具有抗肿瘤作用。