【材料】双重“笼闭”荧光连接基元：高效生物缀合与原位效率的定量

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注：文末有研究团队简介 及本文作者科研思路分析

多肽/蛋白质/抗体与合成聚合物/药物/探针的共价偶联可用于制备临床上非常重要的蛋白质-聚合物缀合物和抗体-药物/探针缀合物。其中，蛋白质-聚合物缀合物可以增强蛋白质的稳定性、延长其体内的循环时间等；抗体-药物/探针缀合物赋予药物/探针位点的特异性靶向，并提高治疗/诊断效果。这几类缀合物的制备关键是恰当地选择连接基团与高效的“点击”反应。此外，该领域的另外一个挑战是如何简便、实时、原位地监控蛋白/抗体缀合物制备中的缀合效率。

中国科学技术大学高分子化学与超分子功能材料研究团队的刘固寰博士在该方面取得了重要进展。他们聚焦于利用激活荧光发射的高效偶合反应实时、原位地监控纳米组装体的解离、物理负载抗肿瘤药物与质粒DNA的释放过程。在近期的一项工作中，含有两个不同官能团的香豆素衍生物C3作为核心分子，通过“Click”反应键接到含叠氮侧基的温敏性高分子中，构建巯基反应性双亲水嵌段共聚物（DHBCs），其中温度敏感嵌段的临界胶束化温度受含巯基生物分子（如谷胱甘肽、半胱氨酸等）的Michael加成反应调控，同时该反应过程伴随着荧光发射的显著增强。研究过程中该团队无意间发现，C3分子具有非常独特的性质。C3分子与含巯基的分子反应过程中荧光发射并无明显变化，而只有“Click”反应发生后的分子才具有巯基反应性荧光增强特性。也就是说，C3分子只有“点击”反应与Michael加成反应同时进行才能增强其荧光发射强度，即C3分子的荧光被炔基与α,β-不饱和酮双重“笼闭”（double “caged”）。

因此，C3分子可以作为重要的桥连基元、共价键合蛋白质与功能分子制备生物相关的缀合物：（1）“Click”反应与Michael加成反应都具有高效与选择性的特征；（2）只有缀合物具有强荧光发射，因此可以通过荧光增强原位监测缀合效率。但最初的尝试结果令人失望，牛血清蛋白（BSA）与端叠氮基的聚环氧乙烷（PEG）缀合效率较低，可能是因为α,β-不饱和酮具有较低的巯基反应活性。

基于以上考虑，作者进一步设计了C2，利用马来酰基替代α,β-不饱和酮作为高巯基反应性的荧光“笼闭”基团。非常遗憾的是，C2失去了双重“笼闭”特性，单独的Michael反应即可增强荧光。经过大量的文献调研，作者最终设计出C1分子，利用炔基共轭键连接在香豆素上代替炔丙基醚。实验结果表明，叠氮和巯基官能化前体与C1的正交双“点击”偶合反应将生成强荧光发射的缀合物，而C1的单“点击”反应产物基本上保持弱荧光发射。利用C1分子，该团队轻松地制备出嵌段共聚物与蛋白质-合成聚合物缀合物，并且能通过荧光的增强原位监控偶合效率。

为了进一步展示该策略的可拓展性，该“与”逻辑型荧光增强特征进一步与荧光共振能量转移（FRET）过程结合构建荧光比率型抗体-探针缀合物。作者首先构建通过C1双“点击”反应导致的荧光增强监控癌胚抗原单克隆抗体（ACEA）与醌氧化还原酶响应的萘酰亚胺衍生物（QNAM-N₃）的抗体-探针缀合物，随后利用多种肿瘤细胞内过量表达的醌氧化还原酶（NQO1）触发萘酰亚胺结构变化，进而显著地改变抗体-探针缀合物的FRET比率，结合抗体的靶向能力，可以提高缀合物的检测特异性与灵敏性。

这一成果近期发表在Angewandte Chemie International Edition 上，文章的第一作者为中国科学技术大学的特任副研究员刘固寰博士。

该论文作者为：Guhuan Liu, Guohai Shi, Haoyue Sheng, Yanyan Jiang, Haojun Liang and Shiyong Liu 

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：

Double-Caging Linker for AND-Type Fluorogenic Construction of Protein/Antibody Bioconjugates and in situ Quantification

Angew. Chem. Int. Ed., 2017, 56, 8686, DOI: 10.1002/anie.201702748

刘固寰博士简介

刘固寰，中国科学技术大学特任副研究员，2015年于中国科学技术大学获得博士学位，2015-2017年中国科学技术大学从事博士后研究。

刘固寰博士致力于仿生灵敏响应的智能高分子以及功能生物缀合物的研究，以期用于活体内的高灵敏检测、诊断与治疗，已发表SCI论文22篇，其中第一和通讯作者SCI论文8篇，文章发表于J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Macromolecules 等期刊。文章入选ESI Highly Cited Papers或被ACS选为Editors' Choice Article等；主持包括国家自然科学基金面上项目等5项基金；获1项授权国家发明专利，参加国内外学术邀请报告2次；博士毕业获中科院院长奖、论文入选中科院优秀博士论文。

科研思路分析

Q：这项研究最初是什么目的？或者说想法是怎么产生的？

A：如上所述，该工作的开展源于前期工作中的偶然发现，通过升华与提炼，最终提出了荧光双重“笼闭”的概念，并筛选出合适的核心分子。为了进一步说明该策略的实用性与可拓展性，我们还设计了许多实验来验证该策略能够用于多种场合的高效偶联与偶联效率原位监测。

Q：研究过程中遇到哪些挑战？

A：该研究中最大的挑战是如何筛选出合适的核心分子，在这方面我们做了大量的文献调研，并且进行了多次的合成尝试。此外，为了验证该策略的普适性，我们花费大量的时间考虑在哪些重要的生物相关领域能够使用该策略以及如何设计分子证明该策略相比传统方法具备优势。另外，这项研究属于交叉学科的研究，其中需要不少生物方面的背景知识，而我们的团队主要来源于化学和材料专业，很多相关技术与知识都是从头积累，过程相对艰辛漫长。

Q：该研究成果可能有哪些重要应用？哪些领域的企业或研究机构有可能从该成果中获得帮助？

A：该双重“笼闭”策略可用来制备临床上非常重要的蛋白质-聚合物缀合物和抗体-药物/探针缀合物等多种生物相关的缀合物，并实现简单、原位地监控缀合效率；此外，连接基元本身具备的荧光发射特性也为设计制备多功能化的诊断、治疗试剂提供更多的选择，这些都将推动疾病诊断与治疗领域的发展，引起相关领域企业或研究机构的重视。

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