Plus深读 | 异染色质编码的卫星RNAs诱导乳腺癌

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276518303459

异染色质重复卫星RNAs在人类不同癌症中广泛转录，包括BRCA1突变的乳腺癌1。细胞中异常表达卫星RNAs诱导DNA损伤响应，激活细胞周期检验点，导致染色体分离缺陷2。然而，卫星RNAs导致染色体不稳定的机制尚不完全清楚。在本文中，该研究工作者发现在小鼠乳腺中，促进卫星RNAs表达会诱导癌症形成，进一步质谱分析发现，卫星RNAs通过与稳定DNA复制叉的BRCA1相关的蛋白网络相互作用诱导基因组的不稳定性。该研究为研发用于封闭非编码卫星RNAs作用的新型癌症治疗方法奠定了基础。

一、主要实验材料和方法

1，实验材料

（1）细胞系

①293T；②U2-OS；③MCF7；④67 NR；⑤M3L2；

（2）动物：

①野生型B6D2小鼠；②MMTV-Cre转基因小鼠；

2，实验方法

（1）免疫组化；

（2）CRISPR SAM实验3：将失活的Cas9与转录激活因子VP64构建融合蛋白，在sgRNAs指导下，定向转录激活靶基因表达；

（3）DNA fiber assay实验4：用于检测新合成DNA长度，在本文中，分别使用5-iododeoxyuridine (IdU)和5-chlorodeoxyuridine (CldU)在标记HU处理前后新合成的DNA，详见本文及参考文献；

（4）iPOND assay5：即isolation of proteins on nascent DNA，指的是在新生的DNA上分离蛋白质，详见本文及参考文献；

（5）G带核型分析：用于分析染色体结构；

补充知识及缩略词：

1，卫星RNAs（Satellite RNAs）6：是一类长度为20~1500nt的非编码RNAs，其转录自含有大量重复序列的卫星DNA，主要存在真核生物染色体的着丝粒和端粒。

2，Neocarzinostatin (NCS)：诱导DNA双链断裂（DSBs）；

3，Hydroxyurea (HU)：导致DNA复制压力；

二、实验结果

1，表达卫星RNAs直接诱导DNA损伤响应和染色体不稳定性

为确定合成的卫星RNAs或染色体卫星RNAs的招募是否是DNA损伤响应所必须的，该研究工作者在人原代纤维母细胞中注射体外合成的hSATa（human satellite RNA），同时以γ-H2AX作为监测DNA损伤响应的marker，如图1A，与对照相比，注射卫星RNAs后，细胞内的γ-H2AX显著增高，提示 卫星RNAs表达升高能诱导DNA损伤响应 ，在人骨肉瘤细胞U2OS中也是如此（如图1B）。接着，该研究小组在细胞中注射了不同的卫星RNAs：hSATa（α卫星RNA）、CFXr（γ卫星RNA）、MajSAT（1.4kb的γ卫星RNA）以及Spombe（S. pombe的卫星RNA），如图1C，与对照组相比，hSATa、CFXr和MajSAT都能增加γ-H2AX的表达，即诱导DNA损伤响应，该结果通过Western Blot得到进一步验证（如图1D），此外，另外一个DNA损伤marker p-Chk1也是显著上调，但组蛋白修饰H3K9me3并未受到影响（如图1C和1D）。因此， 高水平的卫星RNA直接诱导DNA损伤响应。 接着，该研究小组分别使用NCS（诱导DSBs）和HU（导致DNA复制压力）处理U2OS细胞，同时注射hSATa卫星RNA，如图1E，hSATa加重HU诱导的DNA损伤响应， 这提示卫星RNAs诱导的DNA损伤响应可能是由于DNA复制压力介导的。 进一步的克隆生存实验发现，hSATa降低HU处理后细胞的生存能力，而对NCS几乎没有影响（如图1F）。

图1 卫星RNAs能诱导DNA损伤响应

2，激活内源性的卫星RNAs诱导DNA损伤响应和染色体不稳定性

该研究小组使用CRISPR激活技术，通过sgRNAs靶向激活着丝粒周围卫星RNA（major satellite，MajSAT）和着丝粒卫星RNA（minor satellite，MinSAT），如图2A，与对照18s RNA相比，MajSAT和MinSAT表达水平显著升高。此外，激活MajSAT和MinSAT表达后，细胞有丝分裂异常（如图2B），形成微核（如图2C）。进一步研究发现， 激活MajSAT和MinSAT表达增加γ-H2AX表达，即诱导DNA损伤响应。 进一步的G带核型分析发现，如图2E，激活MajSAT表达后导致染色体破裂（红色箭头）以及染色体畸变（蓝色框内），即 激活卫星RNAs导致染色体不稳定性。 因此，与上述研究一致， 激活内源性的卫星RNAs诱导DNA损伤响应和染色体不稳定性。

图2 CRISPR介导卫星RNA表达激活导致染色体不稳定性

3，卫星RNAs诱导乳腺癌

为确定卫星RNAs是否诱导小鼠癌症形成，该研究小组通过在小鼠乳导管内注射表达人源卫星RNAs hSATa和鼠源卫星RNAs MajSAT以及sh-P53的慢病毒（如图3A）， 感染表达卫星RNAs病毒的小鼠后，超过60%小鼠形成乳腺癌 （如图3B），而阳性对照表达原癌基因GTPase HRas（H-RAS）的病毒感染小鼠后，75%小鼠形成乳腺癌。进一步免疫组化检测乳腺癌marker Vimentin和CK8在过表达卫星RNAs呈高表达（如图3C），RT-qPCR检测卫星RNAs在感染相应病毒后表达显著提高（如图3D）。因此， 卫星RNAs能诱导小鼠乳腺癌形成。

图3 在乳腺中注射慢病毒过表达卫星RNA促进肿瘤形成

4，卫星RNAs与BRCA1相关蛋白网络相互作用

图4 质谱确定与卫星RNAs结合的蛋白

基于上述研究 ，该研究小组假设DNA损伤响应需要招募卫星RNAs及相关蛋白到染色体上。 该研究小组构建了doxycycline (Dox)诱导表达的卫星RNAs的慢病毒载体，同时含有MS2外壳蛋白结合位点（如图4A），这个载体同时表达MS2-GFP融合蛋白，通过流式细胞术富集GFP阳性细胞，即能表达卫星RNAs的细胞，接着通过Dox处理诱导卫星RNAs表达，通过抗GFP单链抗体富集与卫星RNA结合的蛋白，将富集蛋白进行质谱分析。如图4B，大多数蛋白与BCRA1相关。接着通过RNA IP实验，该研究小组验证了卫星RNAs与MCM4、Lamin B1、Lamin A 相互作用（如图4C），但卫星RNAs也与BRCA1相互作用（这是质谱没有检测到的）。基于此， 该研究工作者思考BRCA1是否与上述蛋白存在相互作用呢？有趣的是，BRCA1的确与Lamin B1以及BARD1存在相互作用（如图1D），更有意思的是，这种相互作用具有RNA依赖性。 因此，该研究小组确定了一个与卫星RNA相互作用的BRCA1相关的蛋白质网络。

图5 过表达卫星RNA通过蛋白结合伴侣诱导染色体的不稳定性

5，卫星RNAs通过与BRCA1相关的DNA复制叉保护蛋白网络相互作用诱导DNA损伤响应及染色体不稳定性

Lamin B1对于染色体的不稳定性至关重要7，该研究工作者思考 Lamin B1是否参与DNA损伤响应且在卫星RNAs的下游呢？ 基于此，该研究工作者在U2OS中敲减Lamin B1，并在此基础上，过表达卫星RNAs hSATa，如图5A，与对照组相比，敲减Lamin B1显著抑制γ-H2AX形成，即减少DNA损伤，这提示 卫星RNAs结合蛋白Lamin B1在卫星RNAs诱导DNA损伤中起作用。 为进一步确定卫星RNAs与DNA复制相关的MCMs蛋白的相互作用是否具有功能作用，该研究小组进行了DNA fiber assays，如图5B，在HU处理前，转染hSATa卫星RNAs的细胞中新合成的DNA更短，而在移除HU后，与对照组相比，转染hSATa卫星RNAs和MajSAT卫星RNAs的细胞中新合成的DNA都很短，这提示 卫星RNAs能延缓DNA复制或者在DNA复制重启后延缓DNA复制叉起始。 然而，过表达BRCA1能挽救卫星RNAs导致的DNA复制延缓（如图5C）。为确定在HU处理时受卫星RNAs影响的DNA复制叉附近的蛋白复合体，该研究工作者通过iPOND实验发现卫星RNAs表达显著增加γ-H2AX（如图5D），同时降低DNA复制相关蛋白MCM3、MCM4、MCM7和PCNA，相似地，结合在复制中DNA的Ku70和Lamin B1也在降低。因此， 卫星RNAs破坏保护DNA复制叉以及减少DNA损伤的BCRA1相关蛋白的功能。

图6 卫星RNA介导的RNA与DNA杂交的形成

6，卫星RNAs诱导的DNA复制缺陷需要形成RNA-DNA杂交

为进一步探索卫星RNAs如何诱导DNA复制缺陷，该研究工作者通过使用抗RNA-DNA杂交的抗体S9.6对其进行免疫荧光，如图6A，过表达卫星RNAs后与DNA相互作用显著增加，而过表达RNase H降解RNA-DNA杂交的RNA后，γ-H2AX显著降低（如图6B和6C）。为确定RNase H表达对于卫星RNAs诱导的DNA复制缺陷的作用，该研究工作者使用Edu标记新合成的DNA，并通过流式分析，如图6D， 与单独过表达卫星RNAs相比，过表达RNase H后， S期细胞显著增加，这提示DNA复制增加。 因此，RNA-DNA杂交形成显著促进卫星RNAs介导的DNA损伤响应。

三、总结与思考

该研究发现过表达非编码卫星RNAs能显著提高γ-H2AX的表达，诱导DNA损伤响应，促进小鼠乳腺癌形成，在此基础上的进一步研究确定了与卫星RNAs相互作用的蛋白质网络，并确定卫星RNAs与BCRA1的相互作用，而且发现卫星RNAs诱导的DNA损伤响应与DNA复制压力有关，且需要RNA-DNA杂交，这一发现拓展了我们对于肿瘤发生发展中DNA损伤机制的认识。该研究本身也有许多值得我们学习的地方，整理如下：

1，该研究小组在得到质谱结果后，除了验证结果外，同时检测了乳腺癌中经常突变的BRCA1蛋白与卫星RNAs是否存在相互作用（质谱并未检测到该蛋白）， 这提示我们在开展课题时对于关键基因的理解和认识或许会让我们有意外的收获 ；

2， 该研究小组除了外源过表达卫星RNAs，还使用了最新的技术CRISPR激活技术激活內源卫星RNAs的表达， 这也是本文的一个亮点，或许会成为将来的一种趋势，即通过CRISPR激活技术激活內源基因表达而非通过外源过表达某基因来研究该基因的功能。

1. Zhu, Q. et al. BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing. Nature 477 , 179-84 (2011).

2. Morris, K.V. & Mattick, J.S. The rise of regulatory RNA. Nat Rev Genet 15 , 423-37 (2014).

3. Konermann, S. et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature 517 , 583-8 (2015).

4.  Jackson, D.A. & Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. J Cell Biol 140 , 1285-95 (1998).

5. Sirbu, B.M. et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev 25 , 1320-7 (2011).

6. Chan, F.L. & Wong, L.H. Transcription in the maintenance of centromere chromatin identity. Nucleic Acids Res 40 , 11178-88 (2012).

7. Butin-Israeli, V. et al. Role of lamin b1 in chromatin instability. Mol Cell Biol 35 , 884-98 (2015).

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