知道通路中的相关靶点，要怎么来验证呢?

今天和大家分享的是2017年6月发表在Science Translational Medicine上的一篇文献。该文献标题为“ Targeting KRAS-dependent tumors with AZD4785, a high-affinity therapeutic antisense oligonucleotide inhibitor of KRAS ”（回复 170712 可下载文献，一周有效）。

早在1982年，就有研究发现了KRAS是一个重要的原癌基因。KRAS是RAS GTP酶家族的一种的同工酶，主要催化GTP和GDP之间的转化，从而影响细胞内外信号转导。

KRAS基因具有高度突变活性，20%人类恶性肿瘤中发现活化的KRAS基因突变，其中就包括高度恶性的胰腺癌、结直肠癌以及非小细胞肺癌。研究者们一直致力于寻求直接靶向KRAS突变基因或间接抑制KRAS基因通路的方法来治疗恶性肿瘤，但是，临床试验表明目前发现的这些方法并不能使患者获益。

反义核苷酸（ASO）治疗是指与目标基因序列mRNA互补配对的RNA，通过与mRNA结合成双链，实现对目标基因特异性的Knockdown，消除该基因在疾病发生发展中的作用。本研究证实了反义核苷酸（ASO）AZD4785在治疗KRAS突变依赖型肿瘤的重要作用。

本文有7张大图：

1． AZD4785高效、高度选择性下调KRAS mRNA转录和蛋白质合成；

2． AZD4785对KRAS野生型和突变型细胞增殖以及MAPK信号通路的影响；

3． AZD4785对MAPK通路的抑制作用不受该通路的负反馈调节；

4． AZD4785在KRAS突变型异基因小鼠肺癌模型中的有效性和药代动力学；

5． AZD4785在KRAS突变型异基因肺癌PDX模型中的有效性和药代动力学；

6． AZD4785在KRAS野生型异基因肺癌PDX模型中的有效性和药代动力学；

7. 小鼠和猴模型研究系统性ASO治疗的安全性和耐受性。

Fig.1 AZD4785是经过限制性乙酯化修饰(cEt)的二代ASO，对于野生型和突变型KRAS mRNA 3’非编码区具有更高的选择性和抑制活性，并且不需要其他药物辅助就能够进入到细胞内。

研究者首先在A431子宫内膜癌细胞中对AZD4785进行研究发现其高度选择性地使KRAS mRNA选择性下调，但是不影响同家族的HRAS和NRAS mRNA。

同时ZAD4785相应的使KRAS蛋白表达下降但是不影响HRAS和NRAS基因编码蛋白的表达。AZD4785对KRAS基因的抑制作用呈现出剂量依赖性。

Fig.2明确了AZD4785对KRAS基因的高度特异性抑制作用后，研究者进一步在肺癌、结肠癌以及胰腺癌细胞中探究了AZD4785引起的KRAS基因表达的缺失对于肿瘤细胞增殖的影响，发现AZD4785对野生型和突变型KRAS基因的表达均有明显抑制作用，但是只对KRAS突变型肿瘤细胞集落形成有明显的抑制作用，而对野生型KRAS细胞则增殖则没有明显抑制。

进一步研究表明AZD4785仅减少KRAS突变的细胞内MAPK(RAF-MEK-ERK，调节KRAS活性)下游转录本DUSP6和ETV4转录。蛋白检测也表明AZD4785仅对KRAS突变型肿瘤细胞MAPK下游通路有抑制作用。说明AZD4785能够高度特异性抑制KRAS突变细胞的增殖。

Fig.3针对AZD4785对于MAPK通路的影响研究者也进行了研究，发现其仅对KRAS突变的细胞系中MAPK的抑制作用比MAPK特异性的小分子抑制剂效果更明显，而对野生型KRAS细胞内MAPK下游通路的抑制效果不明显。

并且与MAPK蛋白抑制剂不同的是AZD4785对于KRAS的抑制作用不受MAPK负反馈调节的影响，这一数据也支持将AZD4785与MAPK抑制剂联合应用治疗KRAS依赖性肿瘤的理论。

Fig.4-7为了进一步探究系统性反义核苷酸（ASOs）治疗对于KRAS突变肿瘤的作用以及体内药代动力学，研究者分别用系统性ASOs的方法治疗携带有KRAS突变肺癌的裸鼠以及KRAS突变型或野生型的病人来源肿瘤细胞的裸鼠，发现在裸鼠体内，ASOs能够选择性下调KRAS，也验证了系统性ASOs对于KRAS突变型肺癌能够实现选择性敲除突变的KRAS。

药物代谢动力学以及小鼠和猴的模型也进一步证实了系统性ASOs用于治疗KRAS突变肿瘤的安全性。

研究者通过本实验评估了AZD4785这种靶向KRAS mRNA的经cEt修饰的ASO治疗KRAS突变肿瘤的动物模型的疗效和安全性。