本来想让导师让我做个单细胞测序，但当他知道单细胞测序比我这博士生的命都贵，他就退却了。其实免疫微环境的研究，也并不一定都要进行单细胞测序才行，今天讲的这篇文章，就做得还不错。这篇文章是中山大学附属第一医院妇产科姚书忠团队的博士，发表在10.3分的J Immunother Cancer上的文章，我们就来看看他们做了些什么吧：
首先他们研究的是宫颈癌，他们通过已有的TCGA数据库进行了挖掘。这个挺有意思的，他们要研究的是肿瘤细胞对于CTL（细胞毒性T淋巴细胞）的影响，于是首先通过CD8A、CD8B、GZMA、GZMB和PRF1的表达水平，来判断CTL的状态，给出一个评分。然后分析不同CTL评分等级中，肿瘤细胞内跨膜蛋白的表达情况（这其实就是基于一个假设建立的实验设计，他们首先假设肿瘤表面的跨膜蛋白的表达，有可能会影响CTL的招募和功能，于是就通过这个推导出肿瘤中可能会通过细胞间通讯影响CTL的跨膜蛋白，这个假设的设计就很有意思，不清楚科研假设的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）。他们由此，找到了CDCP1（CUB 结构域的蛋白1）这个跨膜蛋白，他们发现CDCP1在CTL低评分组中高表达，也就是说CDCP1可能在宫颈癌中参与抑制调节CTL功能：
通过进一步的样本分析，他们验证了CDCP1在宫颈癌中的预后价值，并显示了其作为进一步研究的治疗靶点的潜力。由于对病例的验证，还没有办法解释CDCP1对于CTL的影响，但是对预后的影响是可以直接关联起来的。既然假设CDCP1是可以调控CTL，那么就需要进行进一步的敲减或过表达CDCP1进行验证，他们选择的是在免疫缺陷小鼠和正常小鼠中，分别分析肿瘤细胞敲减或过表达CDCP1后的影响（这其实就是柯霍氏法则的验证，通过这个验证，可以得到这样几个结果，首先CDCP1是否与调控免疫细胞有关，其次CDCP1是否与肿瘤细胞功能相关，这就是柯霍氏法则的验证，不清楚柯霍氏法则的话，可以看看《轻松的文献导读》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）。结果他们发现CDCP1的表达与否，在免疫缺陷小鼠中与肿瘤增殖并没有什么直接联系，而在正常的有免疫细胞的小鼠中，CDCP1的表达与否，则会影响肿瘤的生长。也就是说，CDCP1的表达水平以免疫依赖性方式，影响异种移植肿瘤的生长：
那么具体CDCP1影响的是哪一类免疫细胞呢？其实到这里，一般高分的文章，都会用一个单细胞测序来进行验证了。但实际上单细胞测序还是有点贵的，他们这里就用了简单的流式分析机进行了比较，结果发现，CDCP1对体内肿瘤生长的影响，很可能是通过其对肿瘤浸润T淋巴细胞功能的影响来介导的。而进一步，通过共培养分析，他们发现敲减了CDCP1，可以促进CD8+ 的CTLs细胞毒活性增加，降低免疫抑制性Treg细胞，产生抗肿瘤免疫反应：
那么CDCP1是如何影响T细胞的呢？如果CDCP1作为配体，那么就需要有T细胞的膜受体进行参与结合互作，而CDCP1已被确定为CD6的第二个配体。那么CD6是否是T细胞抗肿瘤免疫缺失的关键呢？他们就在这里通过敲减T细胞的CD6，来分析CDCP1是否是通过与之结合影响CTL的（这其实就是反向遗传学的柯霍氏法则验证，通过抑制CD6表达，来分析CD6可能产生的影响，不清楚反向遗传学和柯霍氏法则的话，可以去看看《轻松的文献导读》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）。通过敲减CDCP1的肿瘤细胞和使用了抗CD6抗体的T细胞之间，进行了共培养，结果发现，抑制了CD6的T细胞，的确不会再受到肿瘤细胞的CDCP1的影响了。也就是说，CDCP1通过T细胞上的CD6，减弱了T细胞介导的抗肿瘤免疫：
那CDCP1-CD6结合后，对于T细胞产生了什么样的具体影响呢？于是他们在CDCP1-CD6结合前后，进行了对T细胞的二代测序。结果发现CDCP1-CD6结合，会影响T细胞下游的JAK-STAT信号通路（JAK-STAT信号通路也是十分常见的，与炎症反应相关的信号通路了，通过JAK对于STAT的磷酸化，可以激活下游转录，在免疫细胞中，这个信号通路经常会出现，不清楚的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列复习下）。而肿瘤细胞和T细胞共培养的结果也发现，JAK-STAT信号通路在CDCP1-CD6结合后，受到了明显的抑制。抑制JAK-STAT信号通路，则减少了细胞毒性分子，如GZMB和IFNγ的产生。而使用了CDCP1抑制剂之后，则激活了T细胞中的JAK1-STAT信号通路：
最后，他们使用CDCP1的抑制剂8PN，进行了宫颈癌的小鼠体内实验。结果显示，靶向CDCP1的抑制剂，可以抑制宫颈癌的生长：
对于这一系列实验，就形成了这样的示意图。肿瘤细胞高表达CDCP1通过与T细胞表面的CD6结合，明显抑制了T细胞内的JAK-STAT信号通路，导致CTL的细胞毒性分子GZMB和IFNγ的表达下降。而靶向抑制CDCP1表达，可以激活CD8+ 的CTL，浸润到肿瘤中，抑制肿瘤生长：
这篇文章其实还是挺有意思的，通过一步步的推理和假设的迭代，分析出肿瘤与T细胞之间的CrossTalk，不但找到了膜蛋白CDCP1以及其受体CD6，还确定了对于T细胞的抑制机制，蛮有意思的。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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