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成果简介

广东工业大学环境健康与污染控制研究院、环境科学与工程学院安太成教授团队近期在 Journal of Hazardous Materials ( 2025, 481: 136554 ) 杂志上发表了题为 “Biofilm formation mechanisms of mixed antibiotic-resistant bacteria in water: Bacterial interactions and horizontal transfer of antibiotic-resistant plasmids ( https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2024.136554 ) ” 的研究论文。该论文主要关注水体中不同金属介质表面不同耐药细菌形成不同细菌混合生物膜的形成机理，深入讨论了混合生物膜内不同细菌相互作用和耐药基因水平转移对混合生物膜形成过程的影响和作用机制。该研究可为正确理解和精准调控水生环境中生物膜的污染和防控提供一定的技术支持 。

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引言

水体输送管道中生物膜是复杂、高度多样化且动态变化的微生物群落，可以在大多数与水接触的介质表面上形成。单一物种生物膜并不常见，在大多数情况下，微生物的共存会增强生物膜的形成。因此，了解复杂生物膜群落内的相互作用和形成动力学对于更好地阐明膜内微生物的发展趋势至关重要。作为生物膜的重要组成部分，细胞外聚合物物质（ EPS ）在维持结构稳定性、促进种间信息传递和介导抗生素耐药基因（ ARG ）的传递方面发挥着至关重要的作用。因此，阐明 EPS 的组分特性有助于增强我们对输水管道表面生物膜形成和发展的理解。作为生物膜内的天然屏障， EPS 有助于生物膜内的细菌能够快速适应不断变化的环境，质粒介导的抗生素耐药性在病原微生物之间的水平基因转移就是例证。然而，复杂生物膜的形成以及与复杂生物膜内抗生素耐药质粒转移相关的机制仍然知之甚少。抗生素耐药细菌生物膜的复杂群落结构、种间关系和 ARG 的发展无疑构成了挑战。因此，了解由耐药菌（ ARB ）组成的复杂生物膜的形成机制尤为重要。具体来说，与常见的细菌生物膜形成相比，非常有必要阐明 ARB 生物膜形成后耐受性和适应性增加的影响与机制，并进一步揭示 ARB 生物膜形成与 ARG 转移之间的关系 。

为了回答上述问题，在该项研究中我们使用大肠杆菌（ E. coli ）菌株，通过 ARB 菌株 E. coli RK2 、 E. coli C600 以及 ASB 菌株 E. coli K12 创建了不同细菌的混合生物膜。然后，我们探索了铁片作为金属基底上的生物膜群落中细菌的结构组成和空间变化，以及探讨生物膜内细菌信息的交换。特别是，研究了遗传物质的接合转移效率和与生物膜分子生物学的相关机制。本研究的目的主要是深入了解生物膜形成与基因水平转移之间的相互关系，这对于自来水分配系统中的生物膜的污染和防控策略非常重要。

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混合菌的生物膜生长活性及生长机制

首先，测量细菌在单个生物膜和混合细菌生物膜中的生长活性和厚度（ 图 1 ）。发现其中单一生物膜的菌群丰度峰值相比混合生物膜要小得多。此外，在 0 − 72 h 内，两种混合生物膜的生长丰度超过了形成混合生物膜的两个单细菌生物膜的平均生物量。这表明在两个混合生物膜中构成混合生物膜的不同细菌之间存在协同关系。细菌之间的协同作用增强了混合生物膜形成的能力，促进细菌更快地适应环境。奇怪的是，由 ASB 和 ARB 形成的混合生物膜在 72 h 后细菌丰度迅速下降。在此期间，由 ASB 和 ARB 形成的混合生物膜的生长丰度低于形成混合生物膜的两个单一生物膜的平均生物量，表明混合生物膜内的细菌之间存在竞争关系。相比之下，由两种 ARB 形成的混合生物膜仍表现出协同关系，混合生物膜在生长后期更加稳定。与 ASB 相比， ARB 更有可能在不利的环境中生存并保持相对稳定的群落结构， ARB 携带的 ARG 可能充当 “ 增强基因 ” 以提高细菌存活率。此外，在相同的孵育条件下，混合细菌形成的生物膜厚度比单一物种处理形成的生物膜厚（ 图 1c-1d ）。生物膜厚度与细菌丰度的变化高度一致。然而，单个 ARB 的生物膜厚度远低于单个 ASB 生物膜的生物膜厚度，这与上述结果一致（ 图 1c ）。

图 1. (a) 单个细菌（ E. coli K12 、 E. coli C600 和 E. coli RK2 ）和 (b) 混合细菌（ E. coli K12& E. coli RK2 、 E. coli C600& E. coli RK2 ）的生物膜生长曲线。 1/2( E. coli K12& E. coli RK2) 代表单独培养的 E. coli K12 和 E. coli RK2 生物膜的理论生长量的一半。 1/2( E. coli C600& E. coli RK2) 代表单独培养的 E. coli C600 和 E. coli RK2 生物膜的理论生长量的一半。当 1/2( E. coli K12& E. coli RK2) 或 1/2( E. coli C600& E. coli RK2) 大于、小于或等于混合生物膜的生长量，表明两种细菌之间分别存在拮抗、协同或互不干扰的关系； (c) 单个细菌（ E. coli K12 和 E. coli C600 ）和 (d) 混合细菌（ E. coli K12& E. coli RK2 和 E. coli C600& E. coli RK2 ）的生物膜厚度。

在相同的孵育条件下，混合细菌生物膜比单个细菌生物膜分泌更多的 EPS （ 图 2 ）。 ASB 和 ARB 混合菌形成的生物膜中分泌的 EPS 在 56 小时时达到最高值 920.2 μg/mL ，总碳水化合物含量是蛋白质的 0.9 至 1.8 倍（ 图 3a-3b ） 。相反，混合 ARB 生物膜分泌的 EPS 量最高，在 48 小时时达到最大浓度 970.0 μg/mL ，碳水化合物与蛋白质的比例在 1.0 − 2.1 之间（ 图 3c-3d ）。这一结果进一步解释了为什么混合细菌生物膜比单个细菌生物膜表现出更高的群落丰度。 EPS 影响生物膜结构中不同细菌的定位，并在细菌之间的相互作用中起关键作用。此外， EPS 的丰度越高，它对双物种细菌生物膜的传播贡献就越大。生物膜中的碳水化合物与蛋白质的比例也因细菌种群而异。 EPS 中多糖的含量和比例在细菌细胞附着和生物膜的结构稳定性中起着重要作用，可以促进细菌在初始附着过程中的稳定生长 。 在本研究中，混合 ARB 生物膜表现出最高的多糖比例，这无疑是其稳定性较高的主要原因。

图 2 . 对培养至 72 h 不同组分生物膜 Live/Dead 染色后三维重建及不同组分生物膜的 SEM 图像

图 3. (a) E. coli K12 和 E. coli RK2 ， (b) E. coli C600 和 E. coli RK2 混合细菌生物膜 EPS 浓度； EPS 中蛋白质和碳水化合物含量的比例随 (c) E. coli K12& E. coli RK2 (d) E. coli C600& E. coli RK2 生物膜发育的变化。

即使在生长不稳定的混合生物膜中也可以发生水平基因转移

为了更有效地研究导致 ASB 和 ARB 形成的混合生物膜不稳定的潜在因素，本研究采用流式细胞术分析生物膜内的荧光分布，从而评估不同细菌种群比例的动态变化。同时显示绿色和红色荧光的代表 ARB E. coli RK2 ，只显示红色荧光而没有绿色荧光的代表质粒丢失的 E. coli RK2 ，而显示绿色荧光的代表已获得抗生素耐药质粒的转偶联物。在 E. coli K12& E. coli RK2 形成的混合生物膜中，随着孵育时间的增加， ARB 的数量逐渐减少，而 ASB 的数量逐渐增加，在第 4 天占所有细菌的 85% ，成为优势物种（ 图 4 ）。此外， ARB E. coli RK2 在初始孵育期间显示出最高的质粒损失（ 10% ）。 ARB 的数量在 0 到 5 天之间也大幅减少，似乎较高比例细菌死亡（ 图 5 ）。 E. coli K12& E. coli RK2 形成的混合生物膜内细菌组成的显着波动进一步导致了生物膜结构的不稳定性。尽管这种生物膜系统不稳定，但生物膜内的细菌之间仍可能发生 ARGs 的接合转移，或者从细菌中丢失的裸质粒可能进入受体细菌。生物膜被认为是传播 ARGs 的主要驱动因素，因为生物膜中细菌的紧密接近增强了细胞间的接触，从而增强了基因交换的可能性。因此，基因转移频率的增加可以促进 ARGs 在生物膜内的传播并增加细菌对抗生素的耐药性。这一假设可以通过新 ARB 的形成来证实，在孵育 2 − 3 天后，占所有生物膜内细菌的 25 % − 33 % （ 图 4a ）。这些结果表明基因水平转移可以并且已经发生，且 ARGs 具有很强的在生物膜内扩散的能力 。

图 4. (a) E. coli K12& E. coli RK2 混合生物膜中细菌的比例， (b) E. coli C600& E. coli RK2 混合生物膜中细菌的比例。

图 5. 流式细胞术监测 E. coli K12& E. coli RK2 混合生物膜孵育期间细菌比例的变化。

不同混合生物膜中抗生素耐药基因的接合转移效率

如上所述，混合生物膜群落结构比例的动态变化和流式细胞术数据都揭示了混合生物膜内细菌细胞之间 ARG 传播的发生。也就是说， ARGs 的转移发生在两个混合生物膜的形成过程中。此外，生物膜内各种细菌的比例随着时间的推移表现出动态变化。为了进一步阐明细菌在生物膜内交换基因信息的规律性并确定 ARGs 在其中传播的能力，计算了 ARGs 的接合转移频率。以 E. coli K12 为受体， E. coli RK2 为供体的混合生物膜中 ARGs 的接合转移效率在孵育第 2 天达到峰值，从 2.6 × 10 ⁻² 至 5.0 × 10 ⁻¹ ( 图 6a ），增长了 19 倍。这一结果表明，生物膜内细菌之间的紧密接触增加了 ARG 转移频率，并且这种接合转移频率远高于浮游细菌。然后在生物膜生长的后期 （孵育的第 3 − 5 天），接合转移频率逐渐降低。此外，传代实验的结果表明，在 ASB 和 ARB 形成的混合生物膜中通过接合转移获得的菌株表现出遗传稳定性。这一发现排除了由于接合细菌的不稳定性而导致接合转移频率降低的猜想。这表明 ASB 和 ARB 形成的混合生物膜中接合转移频率降低是由于 EPS 中多糖比例低导致生物膜结构不稳定， ASB 和 ARB 之间的竞争加剧。因此，接合细菌在培养的后期减少，生物膜开始脱落 。

在以 E. coli RK2 为供体和 E. coli C600 为受体的混合生物膜中， ARG 的接合转移频率增加了 100 倍，从第一天的 6.0 × 10 ^{− 3} 到第 5 天的 6.0 × 10 ^{− 1} （ 图 6b ）。这种接合转移系统不同于上述由 E. coli K12& E. coli RK2 形成的混合生物膜系统， ARG 的接合转移频率在孵育第 2 天后逐渐降低。这表明在 E. coli C600& E. coli RK2 混合生物膜系统中，细菌的交流更紧密，共轭转移频率显着增加。同时，通过 ARG 接合转移从生物膜中获得的接合菌也具有遗传稳定性，并且具有更好的耐药性。两种混合生物膜之间的不同结果可能与它们的生物膜结构有关。最近的一项发现表明，生物膜中致密的种群结构通过共轭转移增加了质粒的扩散，并且生物膜的发育可能刺激了共轭机制本身。这种基因共轭转移机制可能通过生物膜中的自催化来促进，从而促进有效的生物强化策略。因此，与 ARB 和 ASB 形成的生物膜相比，由两种 ARB 组成的混合生物膜表现出更高的群落丰度和 EPS 丰度（ 图 1 、图 3 ）。此外， EPS 中较高比例的多糖增强了生物膜的结构稳定性，这反过来又促进了 ARGs 在生物膜内的接合转移。因此，这种稳定性进一步增强了生物膜的完整性。

图 6. E. coli K12& E. coli RK2 混合生物膜以及 E. coli C600& E. coli RK2 混合生物膜 内的接合转移频率。

混合生物膜中抗生素耐药基因转移的分子机制

ARGs 在细菌之间的接合转移过程由复杂的基因调控系统控制。为了进一步探索生物膜内细菌之间 ARG 接合转移的分子机制，监测了相关调节基因表达水平的变化。 traH 基因（编码细菌结合转移蛋白）的表达在两种混合生物膜中上调（ 图 7 ），表明 ARG 的结合转移发生在生物膜内的细菌之间。特别是，与 E. coli K12 为受体的系统相比，以 E. coli C600 为受体的系统中 traH 基因的上调更为明显，这进一步证实了 E. coli C600 & E. coli RK2 混合 生物膜中共轭转移的频率增加。在细菌细胞膜上编码信号粒子识别受体的 ftsY 基因也可以促进细菌细胞膜之间的融合和结合。在本研究中， ftsY 基因在以 E. coli K12 为受体的混合生物膜和以 E. coli C600 为受体的混合生物膜中均上调，分别上调 2.0 倍和 5.5 倍。该结果表明，生物膜内的细菌之间存在密切的交流，并且细胞膜似乎融合在一起，促进了 ARG 的接合转移。编码细胞内膜复合物的 gspE 基因与细菌毒力因子的分泌有关。毒力因子也与经历接合转移的质粒密切相关，细菌中毒力因子的分泌表明共轭质粒的释放。在这项研究中，在两种混合生物膜中都发现了 gspE 基因的轻微上调，表明混合培养伴随着细菌分泌毒力因子和共轭质粒的释放。也就是说，细菌中的共轭转移涉及共轭转移蛋白的表达和细胞膜融合信号识别受体的表达，它还与调节毒力因子分泌的膜内复合物相关。因此，很明显， ARGs 的接合转移发生在混合细菌生物膜中的细菌之间，并且这是一个复杂的过程。鞭毛基因 motA 和粘附多糖基因 pgaA 对于刺激生物膜形成都是必不可少的，并且是连接细菌细胞和稳定流体动力学生物膜系统的关键因素。本研究中，以 E. coli K12 为受体的混合生物膜中 motA 和 pgaA 基因均上调，以 E. coli C600 为受体的混合生物膜中 motA 和 pgaA 基因分别上调 3.0 倍和 7.0 倍。也就是说，随着共轭转移相关基因的上调，在生物膜细菌中也可以观察到与生物膜形成相关的基因的显着上调。

图 7. 混合生物膜系统中接合转移相关基因（ traH 、 ftsY 、 gspE ）、耐药基因 RK2 amp 及生物膜鞭毛 motA 和粘附多糖基因 pgaA 的表达水平。