淫羊藿Epimedii Folium为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.、箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxim. 或朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥叶[1]，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的作用，是最常用的补肾和抗风湿药之一[2]。研究显示，淫羊藿中含有大量的黄酮类成分，主要为异戊烯基类黄酮，一般认为异戊烯基黄酮及其苷类为淫羊藿的主要活性成分，如淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C等[2-5]。中药所含的化学成分是其发挥临床疗效的物质基础，明确淫羊藿药材中化学成分对其临床疗效的保证以及质量控制非常重要。
超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）已被广泛应用于中药化学成分的快速鉴定、药物质量控制等多个研究领域[6-7]，可通过将LC-MS扫描的碎片离子信息和化合物裂解规律与对照品或文献比对来快速、准确地分析中药中所含化学成分[8-9]。淫羊藿中不同母核结构的化学成分在ESI-MS中有不同的特征碎片，可根据碎片离子特征和裂解规律鉴定其所含的化学成分。本实验采用UPLC-Q-TOF- MS技术对淫羊藿饮片进行检测，通过与对照品或文献报道比对鉴定其中的化学成分；并通过10批样品化学成分的鉴定结果，确定其中普遍存在的化学成分，为阐明淫羊藿药效物质基础、提高其质量控制水平奠定了实验基础。
1 仪器与材料
Waters AcquityTM超高效液相系统、Waters XevoTMQTOF MS系统（美国Waters公司）；KDM型电热套（山东省鄄城县新华电热仪器厂）；RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；Sartorious BT25S型十万分之一电子分析天平（赛多利斯公司，德国）。
色谱纯乙腈、甲酸购于Acros公司（比利时）；纯净水为屈臣氏蒸馏水；其他分析纯试剂购于天津康科德科技有限公司。对照品金丝桃苷（批号PCM-LBM-001）购于天津士兰科技有限公司；朝藿定A（批号110623-150105）、淫羊藿苷I（批号56725-141019）和脱水淫羊藿素（批号38226-141120）购于南京春秋生物工程有限公司；淫羊藿苷（批号MUST-13120510）、朝藿定B（批号MUST-14062312）、朝藿定C（批号MUST- 14022312）和宝藿苷I（批号MUST-14042211）购于成都曼斯特生物科技有限公司；新绿原酸（批号140322）和隐绿原酸（批号140921）购于上海融禾医药科技有限公司；各对照品质量分数均大于98%。10批淫羊藿饮片均购于原产地，其药材来源及产地信息见表1，饮片标本保存于天津中医药大学科研实验室。
2 方法
2.1 供试品溶液的制备
称取淫羊藿饮片粗粉10 g，加入100 mL 50%乙醇回流提取1 h，滤过，滤渣再加入80 mL 50%乙醇回流提取0.5 h，滤过，合并2次滤液，定容至200 mL，4 ℃保存，备用。进样前用50%乙醇稀释成生药质量浓度为0.01g/mL的样品溶液，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取金丝桃苷 1.03 mg、淫羊藿苷1.01 mg、朝藿定A 1.01 mg、朝藿定B 1.00 mg、朝藿定C 0.99 mg、宝藿苷I 1.02 mg、淫羊藿苷I 1.01 mg、脱水淫羊藿素 0.98 mg、新绿原酸 1.03 mg和隐绿原酸0.99 mg置于10 mL量瓶中，加入50%乙腈溶解定容至刻度，配制成对照品储备溶液。随后取1 mL该储备溶液稀释定容至10 mL，配制成含金丝桃苷10.3 μg/mL、淫羊藿苷10.1 μg/mL、朝藿定A 10.1 μg/mL、朝藿定B 10.0 μg/mL、朝藿定C 9.9 μg/mL、宝藿苷I 10.2 μg/mL、淫羊藿苷I 10.1 μg/mL、脱水淫羊藿素9.8 μg/mL、新绿原酸 10.3 μg/mL和隐绿原酸9.9 μg/mL的混合对照品溶液，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.3 色谱条件
色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm；Waters，美国）；流动相A为0.1%甲酸-水溶液，流动相B为0.1%甲酸-乙腈溶液，洗脱梯度：0～0.5 min，2% B；0.5～1.5 min，2%～10% B；1.5～3.5 min，10%～20% B；3.5～6.5 min，20%～35% B；6.5～12 min，35%～40% B；12～13 min，40%～50% B；13～15 min，50%～75% B；15～16 min，75%～95%；16～17 min，95% B；体积流量0.4mL/min，柱温35 ℃，进样量5μL。
2.4 质谱条件
采用电喷雾电离源（ESI）在负离子模式下采集数据，扫描范围m/z 50～1 000；喷雾电压3.0 kV，干燥气体积流量800L/h，温度350 ℃；雾化气压力2 413 kPa；雾化气为高纯氮气，碰撞气为高纯氩气，选取 [M－H]− m/z 554.261 5的亮氨酸-脑啡肽进行精确质量数校正，数据由MassLynx v4.1（Waters Corporation，MA，USA）工作站采集。
2.5 数据处理
查阅国内外淫羊藿及其同科属植物化学成分研究相关文献，收集整理了淫羊藿中化学成分信息，建立包括化合物中文名、英文名称、结构式、分子式、精确相对分子质量以及特征碎片的淫羊藿化学成分文献信息。通过与对照品和整理的化学成分文献信息比对，分析化学成分的质谱信息，从而对检测到的化合物进行鉴定。
3 结果
3.1 化学成分鉴定
按照“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”和“2.4”项下的色谱和质谱条件对淫羊藿饮片进行UPLC-Q-TOF-MS分析，所得样品的原始基峰离子（BPI）色谱图见图1，对图中所示的29个成分进行了指认。
3.1.1 脱水淫羊藿素母核结构的黄酮类化合物 淫羊藿中该类黄酮化合物（类型A）B环的C-4′位由-OCH3取代，糖基取代发生在C-3位或C-7位[10]。在ESI-MS裂解过程中主要发生脱糖基、脱水等中性分子丢失；在负离子模式下，更容易失去7-位糖基产生基峰离子，而苷元离子较难进一步裂解[11]。因此，将苷元离子m/z367作为鉴别该类化合物的特征离子。据此规律鉴定出该类化合物23个，以化合物9为例说明鉴定过程，其他化合物的鉴定结果如表2所示。
化合物9（tR＝6.18 min）在一级质谱中裂解产生的基峰离子为m/z675，此外还存在明显的m/z 837离子，在二级质谱中产生碎片离子m/z 367。可发现该化合物的质谱行为与朝藿定A对照品一致，故将其鉴定为朝藿定A。推测化合物9在质谱中的裂解过程：[M－H]−离子m/z837，分子式为C39H50O20，失去1分子葡萄糖形成基峰离子m/z 675 [M－H－glu]−离子，离子m/z 675同时失去1分子葡萄糖和鼠李糖后产生母核离子m/z 367 [M－H－glu－glu－rha]−，这也与文献报道一致[3]，故化合物9确定为朝藿定A。
3.1.2 去甲基脱水淫羊藿素母核结构的黄酮类化合物 淫羊藿中该类黄酮化合物（类型B）B环C-4′由-OH取代，该类化合物间的主要差异也是糖基取代的不同，取代方式主要为3-O-、7-O-或3,7-O-双取代[3,11]。在ESI-MS中主要发生脱糖基、脱水等中性分子丢失，特征离子为母核离子m/z353离子。据此规律，共鉴定出该类化合物6个，以化合物19为例简述鉴定过程，其他该类化合物的鉴定结果见表2。
化合物19（tR＝8.21 min）在ESI-MS中裂解主要产生m/z499和m/z 353离子，离子m/z 499.160 8为[M－H]−离子，可能的分子式为C26H28O10，通过MassLynx v4.1软件计算出精确相对分子质量为499.160 4，其精确相对分子质量偏差在5×10−6之内，初步推断该化合物为宝藿苷II（大花淫羊藿苷A），化合物19在二级质谱中给出碎片离子m/z 353，离子m/z353与m/z499相差146，推测离子m/z 499 [M－H]−失去1分子鼠李糖产生离子m/z353 [M－H－rha]−，根据文献给出的精确相对分子质量和裂解过程，推测化合物19为宝藿苷II [11,19]。
3.1.3 其他类型的化学成分 除了上述两大类异戊烯基取代的黄酮类成分外，淫羊藿中还有简单黄酮、有机酸、木脂素、生物碱等其他成分[19, 23-24]。这些成分的鉴定方法与上述两类成分相同，即对照品色谱质谱信息和文献信息进行比对，鉴定结果见表2。
3.2 不同批次淫羊藿饮片中共有成分分析
按照“2.3”和“2.4”项下的色谱和质谱条件进一步对10批淫羊藿饮片进行UPLC-Q-TOF-MS分析，检测的BPI色谱图如图2所示；按照“3.1”项下的方法鉴定10批淫羊藿饮片中的化学成分，结果如表3所示。由表3可看出，不同批次淫羊藿饮片的化学成分存在较大差异，这与饮片的来源、产地有很大关系。为了更好地控制饮片质量，本实验确定了10批样品中的共有成分，分别为木兰碱、金丝桃苷、epimedoside E、淫羊藿属苷A、大花淫羊藿苷B、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、icarisoside F、宝藿苷II、箭藿苷A、箭藿苷B、2″-O-rhamnosylikariside II、宝藿苷I、淫羊藿B和脱水淫羊藿素，共16个成分。确定不同来源饮片中的共有化学成分，有利于饮片药效物质基础研究和质量控制。
4 讨论
本实验采用UPLC-Q-TOF-MS技术对淫羊藿中的化学成分进行快速分析，共鉴定了29个化合物，其中以脱水淫羊藿素为母核的黄酮类成分17个、以去甲基脱水淫羊藿素为母核的黄酮类成分6个、其他化学成分6个，实现了对淫羊藿饮片中化学成分的快速分类及鉴定。此外，本实验还鉴定了10批淫羊藿饮片中的化学成分，确定了10批样品中的共有成分16个，为淫羊藿药效物质基础和质量控制研究提供了实验基础。
参考文献（略）
来 源：王 媛，袁 磊，李遇伯，张艳军. 基于UPLC-Q-TOF-MS的淫羊藿化学成分分析 [J]. 中草药, 2017, 48(13):2625-2631.
