单基因干湿结合，省钱又高效！重庆医科大学：单基因+功能验证+机制，单基因少量实验的典范!

生信图书馆 · 公众号 · · 2024-10-16 19:00

正文

哈喽！有没有想为明年的国自然申请打基础的朋友？那馆长建议，先从单基因分析开始！通过对特定基因的分析，有助于揭示疾病发生发展的分子机制，也能够为临床医生提供重要信息以指导精准医疗、制定个性化治疗方案！今天，馆长分享一篇受国家自然科学基金项目、大学研究生拔尖人才培养计划等项目资助的单基因分析，一起看看文章亮点~

1.单基因+单亚型。该研究聚焦于生长因子受体结合蛋白7（GRB7）在人表皮生长因子受体2阳性（HER2+）乳腺癌（BC）中的生物学功能和调控机制，不仅揭示了GRB7在HER2+ BC中的促进作用，还提出了GRB7作为预后指标和治疗靶点的潜力，为未来的临床治疗提供了新方向。

2. 干湿结合。该研究通过生物信息学分析评估了GRB7的临床意义，后通过体外细胞实验和体内动物模型实验探讨了GRB7在HER2+BC中的生物学功能及潜在分子调控机制。尤其是一系列体内外实验的应用，增强了研究结果的可靠性和说服力！

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题目： TCF12调控的GRB7通过激活Notch1信号通路促进HER2+乳腺癌进展

杂志： Journal of Translational Medicine

IF： 6.1

发表时间： 2024年8月

研究背景

人表皮生长因子受体2阳性（HER2+）乳腺癌（BC）约占所有BC的五分之一，具有高度侵袭性，复发率高，预后差。有研究表明，生长因子受体结合蛋白7 （GRB7）可能是肿瘤诊断和预后的潜在治疗靶点。然而，GRB7在HER2+BC中的作用及其潜在机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨GRB7在HER2+BC中的生物学功能和调控机制。

研究思路

首先，通过TCGA、GEO、 CancerSEA 数据库进行生物信息学分析以评估GRB7的临床意义，并通过RT-qPCR、western blot、免疫荧光检测GRB7在BC细胞系和组织中的表达。其次，通过MTT、EdU、菌落形成、伤口愈合、Transwell和异种移植物试验探讨GRB7在HER2+BC中的生物学功能，并通过在SK-BR-3细胞中转染GRB7 siRNA后进行RNA测序以分析与GRB7相关的信号通路。最后，通过染色质免疫沉淀分析（ChIP）和荧光素酶报告基因分析来阐明GRB7在HER2+BC中的潜在分子调控机制。

主要结果

1. GRB7在BC（尤其是HER2+BC）中的表达及与预后的关联

通过TIMER2、TCGA数据库比较不同类型肿瘤及其相应的正常组织之间GRB7的mRNA水平，结果显示， GRB7在包括BC在内的一些肿瘤中表达显著上调。通过评估GRB7表达与临床病理特征的关系，发现 GRB7高表达的BC患者预后更差。根据BC的分子类型分析GRB7的表达水平，结果显示，与正常组织、管腔A型BC、管腔B型BC、三阴性乳腺癌（ TNBC ）相比，HER2+BC组织中GRB7的mRNA和蛋白水平均显著升高。值得注意的是，GRB7是HER2+BC中前25个过表达基因之一，通过分析GEO数据库证实了GRB7的高表达水平。通过免疫荧光显示HER2+BC中GRB7蛋白的表达水平高于正常人乳腺组织；通过 Kaplan-Meier生存曲线显示，GRB7高表达与总生存期（OS）和无病生存期（DFS）显著降低相关；通过RT-qPCR和western blot检测GRB7在不同BC细胞系和正常人BC细胞系中的表达，结果显示，HER2细胞中GRB7 mRNA和蛋白表达水平高于其他类型的BC细胞系（图1）。

图1 GRB7在HER2+BC中过表达并与不良预后相关

2. GRB7在HER2+BC中的生物学功能

通过对GRB7共表达的基因进行京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析，发现这些共表达基因在细胞生长和粘附信号中广泛富集；通过单细胞分析发现GRB7与BC的细胞周期、上皮间质转化（EMT）、干细胞特性相关；通过基因集富集分析（GSEA）显示，GRB7的表达与细胞周期和凋亡有显著相关性。通过敲低或过表达GRB7以评估其在HER2+BC细胞中的体外和体内作用，通过 MTT实验、细胞集落形成实验、EdU实验、免疫组化染色、western blot分析等一系列实验，结果表明， GRB7对HER2+BC细胞的生存能力至关重要（图2）。通过伤口愈合实验、Transwell实验研究GRB7在HER2+BC细胞迁移和侵袭调控中的作用，结果表明， GRB7增强了HER2+BC细胞的迁移和侵袭。

图2 GRB7促进HER2+细胞在体外和体内的存活和增殖

3. GRB7调控HER2+BC恶性进展的分子机制

通过 RNA-seq技术探索GRB7的潜在靶点及相关信号通路，结果显示，与NC组相比，GRB7敲低组共有862个差异表达基因（DEGs）；通过 KEGG分析显示，以上基因与Wnt通路高度相关；通过 RT-qPCR、western blot、免疫组化染色显示，GRB7与HER2+BC中EMT相关蛋白显著相关。以上表明GRB7促进HER2+BC细胞的EMT，从而促进肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。通过基因集富集分析（GSEA）显示， GRB7与多个信号通路的基因集相关，尤其是Notch信号通路，GRB7的表达水平与Notch1的表达水平密切相关；通过免疫沉淀（IP）实验发现GRB7和Notch1相互作用；通过使用 Notch信号的选择性抑制剂FLI-06，发现FLI-06下调Notch1的表达，显著削弱了GRB7过表达诱导的HER2+BC细胞的增殖、迁移和侵袭（图3）。以上结果表明， GRB7通过Notch和其他信号通路促进HER2+BC 。通过Cistrome DB数据库预测可能调控GRB7表达的转录因子（TF），通过相关性分析显示，TCF12与GRB7表达相关性最强；通过 ChIP-PCR、荧光素酶报告基因检测、RT-qPCR、western blot检测，结果表明， TCF12可以结合GRB7启动子区域，从而增强GRB7的表达（图3）。

图3 TCF12结合GRB7启动子促进GRB7的表达

通过敲除TCF12、菌落形成、EdU实验、异种移植模型等以验证TCF12是否参与GRB7在HER2+BC中的功能，结果表明，GRB7是TCF12调节HER2 BC进展的关键靶点。

图4 GRB7通过增加TCF12诱导的EMT减少来促进HER2在体内的进展

文章小结

该研究证明了GRB7在HER2+ BC中高表达并且与患者预后相关。GRB7在功能上促进HER2+ BC细胞的增殖、迁移和侵袭。在机制上，GRB7受TCF12的转录调控，与Notch1相互作用，并通过激活Wnt/β-catenin通路和其他信号通路促进HER2+ BC细胞的EMT进展和增殖。该研究结果阐明了GRB7在HER2+ BC中的致癌作用，为HER2+ BC的发生发展提供了新分子机制和治疗靶点。 这样一篇经典的从“生信→功能→机制”的单基因分析就完成了，想复现思路的朋友，快来联系馆长

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