Nature 子刊丨CD38+肺泡巨噬细胞的数量与小鼠肺部结核杆菌的早期控制有关

本体和系内多样性是巨噬细胞对 Mtb 感染反应的关键决定因素

    为了更好地了解巨噬细胞在Mtb感染期间的行为，作者对Mtb挑战后2、3、4、6周的巨噬细胞表型进行了广泛的多模式scRNA-seq分析，这跨越了从先天性免疫反应到适应性免疫反应的过渡时期。作者的目的是确定不同的巨噬细胞群在Mtb感染后是如何反应的，从而确定哪些亚群负责控制反应，哪些亚群有利于Mtb的复制和扩展。与之前的工作一致，作者用hspx'::gfp/smyc'::mCherryMtb 报告株感染小鼠。该菌株组成型表达 mCherry，并在宿主介导的免疫相关压力下表达 GFP。对于每个受感染的宿主细胞，作者都能评估胞内 Mtb 的适存状态，量化表面标记物的表达并分析其转录组9。经过质控后，作者的数据集由 49,600 个细胞组成，其中绝大多数被鉴定为巨噬细胞（图1A）。

    最近的研究表明，常驻的 AMs 和招募的 IMs 在本体上具有多样性，并由表型不同的亚群组成。这些亚群对 Mtb感染表现出明显不同的炎症反应。在目前的研究中，作者扩展了这些发现，根据其来源和炎症特征进一步描述了离散的 AM 和 IMs 亚群。

    AM通常通过其表面标记物SiglecF和CD11c的表达来识别，在作者的数据集中，可以通过SiglecF和CD11c染色来识别AM亚群（图1B）。有趣的是，作者还注意到有一群细胞通过 UMAP 分析与 AM 聚集在一起，但没有 SiglecF 或 CD11c 染色（图1A ，C）。为了确定这些细胞的来源，作者重点研究了早期感染阶段（对照和感染后 2 周）。作者对得到的 13125 个细胞进行了无偏单细胞加权基因相关网络分析（scWGCNA），以确定定义该群体的基因共表达模块。该分析确定了两个基因表达模块，它们反映了 SiglecF 和 CD11c 抗体的不同染色（图1D）。模块 6 由 28 个基因共表达集组成，包括常用于定义组织常驻 AM 的基因，如Cd9、Mrc1(CD206)、Lpl、Trf 和 Chil3(Ym1)（图1E）。相比之下，模块 5 由更大的 110 个基因集代表，由 SiglecF/CD11c 双阴性群体表达，富含与单核细胞系（图1E）和单核细胞向巨噬细胞分化相关的基因。这些 AM 样细胞表达单核细胞向巨噬细胞分化的驱动因子MafB和单核细胞来源细胞的标记物Ly6c2（图1F ）。因此，作者将这一群体命名为 moAMs（单核细胞衍生 AMs）。在对照组小鼠的肺中没有 moAMs，这意味着这些单核细胞在感染 Mtb 后迁移至此并分化以执行 AM 相关功能（图2A）。轨迹和假时分析证实了这一假设，揭示了 moAMs 与经典的 NOS2+和 NOS2-IMs 代表了不同的细胞命运（灰色叶子），它们起源于浸润单核细胞群（根部 2-白色圆圈和分支点 11-黑色圆圈-），具有与白细胞粘附和外渗相关的独特转录特征（图 2b，c）。未感染的旁观者 moAMs 表达与巨噬细胞功能相关的基因，包括吞噬、脂质代谢和 RNA/ 蛋白质合成，表明其作用不仅仅是维持体内平衡（图2D）。Mtb感染的moAMs中基因表达的反差支持了这一观点，Mtb感染的moAMs转为促炎状态，Acsl1、Hmox1、Saa3、Ptgs2、Slc7a11、Clec4e等基因的上调证明了这一点（图2D）。这种转变的标志是Nos2表达的升高以及与hspx'::GFP 高的细菌的关联（图2E）。这些发现与之前的研究一致，之前的研究描述了干扰素-γ在使转录因子 Maf 结合的增强子区域失活方面的作用。这一机制已被证明可抑制 M2 基因的表达并增加单核细胞源性巨噬细胞的活化。这种 moAM 群体表达 CD38（图2F），因此被称为 CD38+moAMs。

    接下来，作者重点研究了 TR-AM，并根据其 CD38 表达确定了两个亚群。CD38+亚群的Nos2表达增加，并与受压（hspx'::GFP 高）细菌相关（图2E,F）。值得注意的是，这些 TR-AMs 对 SiglecF 和 CD11c 呈双重阳性（图1B）。它们还表达模块 6 中的 TR-AM 基因特征（图1D），因此作者将它们注释为 CD38+TR-AM。重要的是，轨迹和伪时间分析将 CD38+TR-AMs 确立为与 moAMs 不同的品系，它们起源于根 1（白圈）就是证明（图2B）。此外，作者还发现了与hspx'::GFP 低的 Mtb 相关的CD38-TR-AMs 亚群，这表明细菌经历的宿主源压力最小（图2E,F）。

在研究 IM 亚群时，作者观察到了类似程度的异质性。虽然两种 IM 群体似乎都来源于浸润的单核细胞（图2B），但Nos2+IM 是 CD38+，而Nos2-IM 缺乏 CD38 表达（图2F）。观察这些群体的转录谱发现，CD38+ IMs 与 CD38+moAMs 和 TR-AMs 相似，显示出与典型促炎反应一致的基因表达谱，而这些反应以前曾与结核病的有效控制有关（图2G）。

    相反，CD38- IM 亚群不仅缺乏Nos2表达，而且还与hspx'::GFP 低的 Mtb 相关（图2E,F）。相对于 NOS2+IMs，这些细胞显示与抗炎反应相关的基因表达增加。其中包括补体蛋白C1q、Ccl8、Ms4a7等的转录本，这些转录本以前已被定性（图2G ）。此外，该亚群仍部分表达与浸润单核细胞共有的外渗和粘附标记（图2C）。这表明它们代表了最近到达的间质单核细胞，它们刚刚受到感染，尚未经历免疫激活。总之，作者的分析确定了具有不同本体和炎症特征的 AMs 和 IMs 亚群。重要的是，作者发现了单核细胞衍生的 AMs 群体，它们能够在 Mtb 感染后过渡到促炎状态，还发现了基于 CD38 表达的两个 TR-AMs 亚群，它们在 Mtb 感染后与不同的细菌表型相关。

促炎症免疫反应与巨噬细胞中 CD38 表达量的长期上升有关

    为了了解Mtb感染后巨噬细胞免疫反应的时间演变，作者研究了促炎基因特征和相关标记物随时间变化的表达模式。根据作者过去的研究，宿主巨噬细胞中Nos2的表达与细菌应激之间存在明显的相关性（图2E）。在此基础上，作者追踪了受感染巨噬细胞群中Nos2表达的时间趋势。如图3A 所示，随着感染的进展，作者观察到一氧化氮产生的增加，这反映在每个细胞中Nos2表达水平（强度）和表达Nos2的细胞数量（流行率）的增加上。流式细胞仪数据证实了这一趋势；hspx'::GFP 感染细胞的 GFP 信号的中位荧光强度（MFI）随着时间的推移而增加，表明随着感染的进行，细菌应激反应加剧（图3B）。重要的是，用hspx'::GFP Mtb 报告菌株感染 Nos2-KO 小鼠，在感染后 2 周和 4 周，Mtb 对 GFP 的诱导作用都很小（图3C）。在 Nos2-KO 小鼠中，Mtb 对 GFP 表达的有限诱导也伴随着细菌负荷的增加（图3D）。最后，在 Rag1 和 IFN-γ KO 小鼠感染后 2 wpi 进行的流式细胞术分析显示，hspx'::GFP 没有诱导表达，这证实了促炎巨噬细胞产生一氧化氮主要依赖于适应性免疫反应。

    与这些数据相一致，作者的表面标记物分析也反映了在Nos2 RNA 水平上观察到的趋势。具体来说，CD38 蛋白水平--一种与炎症相关的标志物--在感染后期会在巨噬细胞中增加（图3E）。标记物 CD11b 也有类似趋势。为了深入了解驱动这些表型的分子机制和生物过程，作者进行了时间依赖性通路分析。该分析确定了 68 条通路，这些通路的表达随着感染的进展而变化（p.adj < 0.05）。随着时间推移表达量增加的通路主要与炎症和抗菌反应有关，在 CD38+巨噬细胞中的表达量过大（图3F）。相反，在感染早期阶段占主导地位的通路大多与CD38-巨噬细胞有关，并与 M2 极化、组织稳态和细菌存活相关的过程相一致，如蛋白激酶 c 信号的负调控75 、抑制细胞凋亡和细胞增殖等（图3F）。与这些观察结果相印证的是，作者的分析显示，随着时间的推移，CD38+巨噬细胞群中的Mtb mRNA读数恢复增加，表明细菌在这些细胞中降解活跃。具体来说，作者注意到感染后 2 周的 Mtb 读数水平较低，从 3 周到 6 周显著增加。

    耐人寻味的是，当关注旁观者巨噬细胞时，作者的分析表明它们的 CD38 染色水平没有变化，与受感染的巨噬细胞形成鲜明对比（图3E）。为了验证这一点，作者利用力导向布局对两种细胞类型进行无偏图聚类。感染细胞根据感染持续时间进行聚类，而旁观者细胞则根据其本体进行聚类，没有时间上的区别（图3G）。这种明显的差异突出表明，作者观察到的炎症反应并不仅仅是宿主巨噬细胞随着时间的推移被广泛免疫激活的结果；相反，它们是由活跃的Mtb感染微调和特异性驱动的。

    总之，作者的研究结果强调了在感染过程中受感染巨噬细胞群的表型和相对比例的动态变化。这种转变强调了 CD38+巨噬细胞的作用，它们似乎与感染控制密切相关。

随着时间的推移，Mtb 感染细胞的相对比例从 AMs 转移到 IMs

    为了量化受感染巨噬细胞群比例随时间的变化，作者采用了最近开发的用于差异丰度测试（DAB）的统计框架。作者用这种方法来评估感染细胞和旁观者细胞的丰度是否在感染过程中发生变化。作者的分析发现，在受感染的 AMs 和 IMs 亚群中，400 个相邻细胞在不同时间点的丰度发生了变化（FDR < 0.1）。这与变化极小的旁观者群体形成了鲜明对比（图4A）。

    属于CD38-TR-AMs 亚群的受 Mtb 感染的邻居在感染后期数量明显下降。与此相反，Nos2+IMs 中的邻居在相同的后期时间点上数量显著增加（图4B）。在更广泛的种群水平上的观察进一步突显了这一趋势：在感染后 2 周（wpi），AMs 占所有受感染巨噬细胞的 80%，但到了 3wpi 时，这一比例降至约 39%，而到了第 4 和第 6 个 wpi，这一比例降至约 15%（图4C）。总之，作者的数据突出表明，随着感染的进展，受感染的巨噬细胞中 TR-AMs 向 IMs 的丰度发生了很大变化，流式细胞仪分析也证实了这一点。这一趋势与旁观者 AMs 和 IMs 的模式形成鲜明对比，后者的比例在分析的时间点上保持一致（图4D）。从感染后 2 周（wpi）开始，Mtb 感染肺中的旁观巨噬细胞比例保持稳定，这表明在作者的感染模型中，此时单核细胞衍生的细胞已经被招募到肺中，但大部分仍未感染（图4C、D），这与之前的报告相似。

    通过研究 CD38+IMs 和 moAMs 之间不同的感染率时间轴，进一步证实了这一前提。尽管假时分析表明这两个群体共同来源于早期单核细胞集群（如图2B 所示），但 CD38+IMs 在感染后第 3 周才成为感染率较高的群体（图4C）。相比之下，相当一部分 CD38+moAMs 在更早的阶段，即在感染后 2wpi 就受到了感染（图4B ，C）。最近的研究为这些观察结果提供了背景。单核细胞衍生的 IM 最初的延迟感染可能是由于结核病发病初期感染偏好肺泡空间。随着病情的发展，受感染的单核细胞从肺泡空间转移到肺间质空间，CD38+Nos2+IMs 的感染率增加，导致受感染巨噬细胞的丰度总体上从 AMs 转移到 IMs。

    总之，虽然从 2wpi 开始，肺部的旁观者 IM 和 AM 总数量保持不变，但作者的数据表明，随着感染从肺泡转移到肺间质，新感染的 TR-AM 数量下降。作者的数据表明，在已确立的感染中，单核细胞衍生的 IMs 是主要的宿主细胞群，占新感染事件的大多数。

早期感染时间点主要是CD38-TR-AM，它们对结核感染的反应相对较弱

    Rothchild 等人的研究强调，小鼠 AMs 在结核病感染的早期阶段表现出强大的抗炎反应，最长可达 10 dpi。据推测，这种早期反应对它们在初始感染过程中的作用至关重要。在前人研究的基础上，作者对 AM 群体的研究发现，CD38- AM 亚群在早期感染中占主导地位。具体来说，在 14 dpi 时，它们占受 Mtb 感染的宿主细胞的 70% 左右（图5A）。为了更细致地了解CD38-AMs 及其数量变化的影响，作者采用了差异丰度测试（DAB），根据它们的对数折变化（LFC）耗竭率对先前识别出的邻近细胞进行分组，以此替代传统的基于聚类的分类方法（图5B）。通过这种方法，作者确定了两个邻近组（第 2 组和第 5 组），它们在感染晚期（>5 LFC）表现出显著的耗竭率。通过研究与这些高 LFC 消耗率组相关的细胞类型（FDR < 0.1），作者发现第 2 组 98% 的细胞属于CD38-TR-AMs 亚群（跨越CD38-TR-AM_1、CD38-TR-AM_2、CD38-TR-AM_3）。至于第 5 组，57% 与CD38-TR-AMs 相关，33% 与 CD38+moAMs 相关（图5C）。CD38-TR-AMs 在以明显的耗竭率为标志的组中的过度代表性，是通过作者的 DAB 方法确定的，并通过scCODA79的成分分析得到了独立证实，这表明这些细胞对 Mtb 感染具有先天的易感性。与不同感染时间点旁观者群体中CD38-TR-AMs 不变的相对丰度相比，这种易感性变得更加明显（图4A ，D）。再加上观察到的随着感染的展开，受感染 AMs 的总体数量下降（图4C），很明显，在感染后期，只有极少数CD38-TR-AMs 受到感染。这突出表明，在 14 dpi 时占优势的CD38-TR-AM 簇在 Mtb 感染后的生存能力很差。除了 CD38- TR-AM_1 簇中与 MoAM 接壤的细胞外，CD38- TR-AMs 在所有感染时间点都没有Nos2映射读数（图5D），这也支持了这一假设（这可能意味着相邻簇间常见的 scRNA-seq 细胞归属错误）。

    对CD38-AMs 的 DGE 分析进一步支持了这一假设。作者发现CD38-AMs 与 AM 群体的已知标记物（Chil3、Lpl、Marco、Mrc1、Trf）相关（图5E）。在研究这些AM群体的转录谱时，作者观察到与脂质代谢有关的基因（如Fabp4、Mgll和Lpl）上调。此外，作者还注意到与电子传递链相关的基因（如mt-Nd1、mt-Nd2、mt-Nd4、mt-Cytb 和 mt-Atp6）表达增加，这些基因参与了细胞的能量代谢。与脂肪酸摄取和转运（如Dbi）、脂滴形成（如Cidec、Plin2）和氧化应激保护（如Gpx1、Gpx4）相关的基因上调进一步补充了这种代谢转录特征。总之，这些数据表明脂肪酸氧化（FAO）代谢发生了转变。重要的是，参与代谢和平衡功能基因的上调与促炎基因表达的减少形成了鲜明对比（图5E）。此外，对CD38-AMs 转录谱的基因本体（GO）功能富集分析也支持这些观察结果。CD38-TR-AMs 的功能特征与肺泡巨噬细胞的特征一致，这些特征已被证明能促进 Mtb 的生长。这些特征包括氧化磷酸化和脂肪酸代谢增加（图5F）。总之，作者的数据表明，通常与 AM 群体相关的广泛抗炎反应是通过CD38-TR-AMs 介导的，在结核病的早期阶段，CD38- TR-AMs 对 Mtb 感染具有高度易感性和敏感性。

CD38+AMs 是控制结核病感染的关键因素

    作者根据 AM 表面 CD38 蛋白的表达对 AM 亚群进行了重新分组。与之前的观察结果一致，CD38+细胞在2周时只占受感染AM总数的12%，但在4周和6周的时间点，这一比例分别增至89%和93%（图5G）。耐人寻味的是，DAB 检测显示，受感染的 CD38+AMs 在不同时间点的数量没有变化（图4A），在感染后期，moAMs 和 CD38+TR-AMs 占受感染 AMs 的大多数（图4B、C）。这种数量上的稳定性，即使在受感染 AMs 整体数量明显下降的情况下（图4C），也意味着这些细胞亚群可能在本质上对 Mtb 感染具有更强的抵抗力。这种解释与观察到的Nos2表达模式相吻合。CD38+TR-AMs 和 moAMs 都表现出双峰Nos2表达，细胞数量和Nos2表达强度都在增加，这表明它们的抗微生物能力会随着时间的推移而增加（图5D）。如前所述，后期 AMs 中 CD38 表达的升高和促炎途径主要由这两种 CD38+群体代表。

    轨迹分析和假时分析为了解这些群体提供了更多信息。虽然 moAMs、CD38- TR-AM_1 和CD38-TR_AM_2 看起来是成熟的终点（灰圈 12、18、17、7、5 和root 3，白圈），但 CD38+TR-AMs 似乎是CD38-TR-AM_3 亚群极化增强后产生的（root 1，白圈和分支点 12、17，黑圈，图2B）。因此，作者推测在随后的感染阶段，CD38- TR-AM_3 亚群的减少可能是这些细胞过渡到 CD38+TR-AMs 的结果，这一点将在随后的段落中强调。最后，对 CD38+AMs 上调基因的富集分析显示，与控制 Mtb 感染相关的通路也上调了（图5H）。这些研究结果表明，CD38+AMs 和CD38-AMs 对 Mtb 感染的不同反应行为是在感染之前在细胞亚群中编程形成的，其中 CD38+AMs 在管理 Mtb 生长和传播方面发挥着潜在的关键作用。

肺内卡介苗接种可扩大 CD38+巨噬细胞群，从而加强对 Mtb 感染的控制

    最近的研究（包括 Mata 等人的研究）表明，在 Mtb 感染前接种肺内卡介苗可诱导肺内巨噬细胞产生保护性反应。为了扩展这一观察结果，作者评估了肺部接种卡介苗如何调节 CD38+/-巨噬细胞对 Mtb 感染的反应。小鼠经鼻接种活卡介苗，2个月后用报告基因smyc'::mCherry/hspx'::GFP Mtb Erdman 感染2周。随后，作者将这些接种过疫苗的小鼠的 scRNA-seq 数据集与现有的时间点分析数据进行了整合。

    对接种卡介苗（n= 3931 个细胞）和未接种卡介苗（n= 2278 个细胞）的小鼠肺部受感染的巨噬细胞群在Mtb感染后 2 周的分析显示出明显的差异。在接种卡介苗的小鼠群中，与hspx'::GFP 高的 Mtb 相关的单核细胞衍生巨噬细胞（图1F和2E）占受感染巨噬细胞的绝大多数，达 74.43%。这与未接种疫苗队列形成鲜明对比，未接种疫苗队列中此类细胞仅占 43.19%（图6A）。分选群体的流式细胞术数据证实了这些发现。卡介苗治疗组的巨噬细胞做出了更有效的反应，更有效地限制了Mtb的复制。接种过卡介苗的小鼠感染细胞中的 mCherry 信号明显降低，比未接种小鼠感染细胞中的 mCherry 信号低约 2 log10倍，这就说明了这一点。此外，两组小鼠中hspx'::GFP 受激细菌的比例也有很大差异： 在未接种组中，GFP 高的细胞占感染细胞总数的 22.6%，而在接种卡介苗的小鼠中，这一比例为 77.78%（图6B）。作者的 scRNA-seq 数据集显示，两组间hspx'::GFP+细胞的分布与作者的流式细胞术数据一致。与这些发现相辅相成的是，作者观察到卡介苗治疗小鼠感染细胞的总体百分比（0.45%）明显低于未接种小鼠（2.08%）（图6B），独立的流式细胞术分析也证实了这一点。根据 CFU 计数评估，卡介苗处理过的小鼠细菌负担总体减少也证实了这一点（图6C）。卡介苗处理过的小鼠和未接种过卡介苗的小鼠在细胞反应上的这些差异突显了其巨噬细胞群的显著变化。卡介苗处理过的小鼠肺部以高度促炎的单核细胞为主，与未接种对照组相比，受感染的CD38-TR-AMs 明显减少（图6D、E）。卡介苗处理的小鼠中受感染的CD38-TR-AMs 比例降低可能是促炎单核细胞招募增加的结果，此外，CD38- TR-AMs_3 也转变为 CD38+的对应物（图6E）。

利用 scWGCNA，作者确定了卡介苗接种小鼠巨噬细胞群独有的 463 个基因的独特共表达模块。该模块高度富集了促炎基因，包括Nos2和Cd38。进一步分析发现，参与小 GTP 酶信号转导的基因大量存在，包括 Rab GTP 酶、鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）和 GTP 酶激活因子（GAPs）。Rab GTPases 因其在内质体转运中的作用而闻名，而 GAPs 和 GEFs 则对膜转运、吞噬和控制肌动蛋白细胞骨架至关重要。它们的表达增加表明卡介苗处理过的巨噬细胞内的胞内转运发生了改变。Mtb细胞内转运的改变和溶酶体融合的增加可限制细菌的生长，并由于免疫激活和自噬的增加而扩大杀灭机制。作者的数据证实了之前的发现，因为作者观察到细胞内转运的增加与卡介苗处理的巨噬细胞中溶酶体和自噬功能相关基因表达的增加密切相关（图6F）。此外，促进巨噬细胞迁移和组织侵袭的基因在卡介苗处理过的肺巨噬细胞中表达增加。这一观察结果与 scWGCNA 模块中 463 个共表达基因的基因集富集分析结果一致。在 GO 和 KEGG 分析中，细胞迁移、运动、细胞程序性死亡和自噬成为卡介苗处理的巨噬细胞中富集的通路。

    卡介苗处理过的巨噬细胞中参与控制 Mtb 感染的促炎基因表达增加，这与其观察到的表型一致。卡介苗处理过的小鼠的一个标志性特征是 CD38 的表达增加。这种免疫控制表型在感染后 4 周仍很明显，证实了 Mata 等人的发现。有趣的是，作者观察到这两项研究在卡介苗接种后受感染巨噬细胞的来源方面存在差异。在作者的研究中，卡介苗处理过的小鼠中受感染的巨噬细胞大多来自单核细胞，而之前的数据表明卡介苗接种后 Mtb 大多局限于AMs。作者认为造成这种差异的原因是促炎性单核细胞衍生细胞的 CD64 染色较弱。为了验证这一假设，作者与 Mata 等人的做法类似，用高感染剂量（5 ×10 3CFU）再次感染卡介苗处理过的小鼠和对照组小鼠。已发表的 CD64 流式细胞仪分选方法可将卡介苗处理过的小鼠中大多数受感染的巨噬细胞识别为AMs。然而，当只对 AMs 独有表达的 SiglecF 进行分选时（图1B），结果表明大多数感染细胞是单核细胞衍生的，就像作者的 scRNA-seq 数据集一样。无论采用哪种门控方法，作者都发现接种卡介苗的小鼠与未接种卡介苗的小鼠相比，受感染的 AMs 百分比持续上升，这表明在 2wpi 和 4wpi，接种卡介苗的小鼠限制 Mtb 生长的能力有所提高。这与作者的 scRNA-seq 结果一致，并突出了CD38-TR-AMs_3 向 CD38+TR-AMs 过渡的极化增强在卡介苗处理的 AMs 中对 Mtb 控制增强的基本作用（图6E）。总之，作者的数据表明，鼻内卡介苗接种后观察到的对Mtb再感染的防御能力增强是由于CD38+单核细胞衍生巨噬细胞的存在增加和常驻CD38+ TR-AMs的活化。

CD38+与CD38-AMs 染色质组织的先期差异与对 Mtb 感染的不同反应有关

    作者的 scRNA-seq 分析显示，对照小鼠和 Mtb 感染小鼠的 AM 群体存在明显差异。具体来说，作者观察到 CD38+moAMs 在感染 Mtb 后被招募到肺部（图2A）。相比之下，CD38+TR-AMs 在感染前就已经存在，主要表现出活性较低的CD38-表型，作者先前将其定义为CD38-TR-AM_3 （图2A,B）。

    为了研究感染前AM亚群的染色质图谱和潜在的表观遗传调控，作者对从对照组小鼠肺部分离的CD45+细胞进行了scATAC-seq分析。基于染色质可及性差异的无偏聚类确定了 10 个不同的聚类（图7A）。将这一 scATAC-seq 数据集与作者的时间点特异性 scRNA-seq 数据（包括幼稚细胞、旁观者细胞和感染细胞）进行整合，发现感染前染色质组织的变化与结核病感染期间观察到的不同转录表型密切对照。通过基因评分，作者根据与每个基因相邻的调控元件的可及性，推断出了 scATAC-seq 样本中每个细胞的潜在基因表达谱。然后，作者按照之前的描述将数据与 scRNA-seq 数据集进行了整合（图7B）。

    鉴于作者的 scATAC-seq 样本只包括来自幼稚小鼠的细胞，作者预计从 scATAC-seq 数据集推断出的基因表达谱将主要与作者的 scRNA-seq 数据集中的幼稚细胞的基因表达谱对照。令人惊讶的是，作者发现 C7 群组细胞的推断基因表达与作者 scRNA-seq 数据中的促炎症 CD38+亚群的基因表达如出一辙（图7B,C），而对照转录图谱，这些亚群在幼稚小鼠中并不存在（图2A）。相反，C6 和 C8 簇与CD38-TR-AMs 吻合，而 C5 簇与 Mki67+AMs 相关（图7B ，C）。为了验证集群 C7 代表的是 CD38+TR-AM，而不是单核细胞来源的 AM，作者检测了单核细胞标记物Mafb和Ly6a 启动子区域内的开放染色质，如前所述，在作者的 scRNA-seq 数据集中，这两种标记物的表达仅限于单核细胞来源的巨噬细胞（图1F）。作者仅在单核细胞衍生细胞中发现了这些标记物的高水平开放染色质，而在 C7 群中却没有发现。

    为了进一步了解为什么在 scRNA-seq 中推断出簇 C7 的基因表达与促炎症群体一致，作者首先评估了转录因子动态，进行了标记峰和主题富集分析（FDR < 0.1，log2FC > 0.5），以确定在不同 scATAC-seq 簇中富集的转录因子结合位点（TFBS）。簇 C7 表现出转录因子结合位点的高度富集，如Smarcc1、Bach1 和Rela，已知这些转录因子可驱动巨噬细胞中的促炎基因活化（图7D）。作者在 scRNA-seq 数据集中进一步验证了这些转录因子的表达，发现它们在感染 Mtb 后被 CD38+促炎巨噬细胞独特表达（图7E）。

    最后，作者对确定 CD38+AMs 的促炎基因（如Nos2、Cd38、Slc7a11、Ccl5、Ptgs2、Il1b 和 Cxcl2）的调控区（距 TSS ±5k）内的开放染色质峰进行了分析，结果显示，与群集 C6 和 C8 相比，群集 C7 的细胞中开放染色质更高，这进一步验证了 CD38+TR-AMs 预先为促炎反应做好了准备。

    总之，作者的分析表明，CD38+TR-AMs 在感染前就存在于小鼠的对照肺中，但它们在转录上处于静止状态，其表观遗传学特征与CD38-TR-AMs 明显不同。这些 CD38+TR-AMs 增加了促炎基因启动子区染色质的可及性，转录因子结合位点显著富集，有可能驱动促炎巨噬细胞的活动并控制 Mtb 的生长。作者的研究结果支持这样一种假设，即不同的TR-AM亚群对Mtb感染的反应在很大程度上是由它们在感染前的内在染色质组织决定的。