作者的 scRNA-seq 分析显示,对照小鼠和 Mtb 感染小鼠的 AM 群体存在明显差异。具体来说,作者观察到 CD38+moAMs 在感染 Mtb 后被招募到肺部(图2A)。相比之下,CD38+TR-AMs 在感染前就已经存在,主要表现出活性较低的CD38-表型,作者先前将其定义为CD38-TR-AM_3 (图2A,B)。
为了研究感染前AM亚群的染色质图谱和潜在的表观遗传调控,作者对从对照组小鼠肺部分离的CD45+细胞进行了scATAC-seq分析。基于染色质可及性差异的无偏聚类确定了 10 个不同的聚类(图7A)。将这一 scATAC-seq 数据集与作者的时间点特异性 scRNA-seq 数据(包括幼稚细胞、旁观者细胞和感染细胞)进行整合,发现感染前染色质组织的变化与结核病感染期间观察到的不同转录表型密切对照。通过基因评分,作者根据与每个基因相邻的调控元件的可及性,推断出了 scATAC-seq 样本中每个细胞的潜在基因表达谱。然后,作者按照之前的描述将数据与 scRNA-seq 数据集进行了整合(图7B)。
鉴于作者的 scATAC-seq 样本只包括来自幼稚小鼠的细胞,作者预计从 scATAC-seq 数据集推断出的基因表达谱将主要与作者的 scRNA-seq 数据集中的幼稚细胞的基因表达谱对照。令人惊讶的是,作者发现 C7 群组细胞的推断基因表达与作者 scRNA-seq 数据中的促炎症 CD38+亚群的基因表达如出一辙(图7B,C),而对照转录图谱,这些亚群在幼稚小鼠中并不存在(图2A)。相反,C6 和 C8 簇与CD38-TR-AMs 吻合,而 C5 簇与 Mki67+AMs 相关(图7B ,C)。为了验证集群 C7 代表的是 CD38+TR-AM,而不是单核细胞来源的 AM,作者检测了单核细胞标记物Mafb和Ly6a 启动子区域内的开放染色质,如前所述,在作者的 scRNA-seq 数据集中,这两种标记物的表达仅限于单核细胞来源的巨噬细胞(图1F)。作者仅在单核细胞衍生细胞中发现了这些标记物的高水平开放染色质,而在 C7 群中却没有发现。
为了进一步了解为什么在 scRNA-seq 中推断出簇 C7 的基因表达与促炎症群体一致,作者首先评估了转录因子动态,进行了标记峰和主题富集分析(FDR < 0.1,log2FC > 0.5),以确定在不同 scATAC-seq 簇中富集的转录因子结合位点(TFBS)。簇 C7 表现出转录因子结合位点的高度富集,如Smarcc1、Bach1 和Rela,已知这些转录因子可驱动巨噬细胞中的促炎基因活化(图7D)。作者在 scRNA-seq 数据集中进一步验证了这些转录因子的表达,发现它们在感染 Mtb 后被 CD38+促炎巨噬细胞独特表达(图7E)。
最后,作者对确定 CD38+AMs 的促炎基因(如Nos2、Cd38、Slc7a11、Ccl5、Ptgs2、Il1b 和 Cxcl2)的调控区(距 TSS ±5k)内的开放染色质峰进行了分析,结果显示,与群集 C6 和 C8 相比,群集 C7 的细胞中开放染色质更高,这进一步验证了 CD38+TR-AMs 预先为促炎反应做好了准备。
总之,作者的分析表明,CD38+TR-AMs 在感染前就存在于小鼠的对照肺中,但它们在转录上处于静止状态,其表观遗传学特征与CD38-TR-AMs 明显不同。这些 CD38+TR-AMs 增加了促炎基因启动子区染色质的可及性,转录因子结合位点显著富集,有可能驱动促炎巨噬细胞的活动并控制 Mtb 的生长。作者的研究结果支持这样一种假设,即不同的TR-AM亚群对Mtb感染的反应在很大程度上是由它们在感染前的内在染色质组织决定的。