设计多色流式分析的10个诀窍

生物通 · 公众号 · · 2017-05-31 17:47

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如今，流式细胞分析在实验室中是越来越常见。然而，设计一个多色的分析却让人很头疼。在此，Bio-Rad的流式专家教你10个技巧，能帮助你设计出一个成功的多色流式分析实验。

熟悉你的流式细胞仪

了解你所用的流式细胞仪的性能，这非常重要。大多数流式细胞仪有两个或多个激光器，有五种波长可供选择：紫外（355 nm）、紫色（405 nm）、蓝色（488 nm）、黄色（561 nm）和红色（640 nm）。除了激光器，具体的滤光片和检测器也决定了你的配置。这些明确了可同时检测多少种颜色（新的仪器可能超过17种）。荧光微球的定期清洗和校准将让你更好地利用流式细胞仪。

恰当地制备你的样品

制备方法不当或不健康的细胞可能导致结果不佳，因为细胞死亡或结块。在制备细胞时，你应当温柔地对待它们，避免剧烈的涡旋振荡。在染色时，如果实验允许，细胞应放在冰上。细胞团块会阻塞流式细胞仪，为了减少团块的形成，应避免高的细胞密度。加入DNase I或EDTA，也是个好办法。

去除死细胞

死细胞可能带来假阳性的结果，因为自发荧光以及非特异的抗体结合增加。通过前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）设门不一定能排除死细胞，因此最好是使用活细胞/死细胞的染料。人们通常用碘化丙啶（PI）或7-AAD来鉴定死细胞，但这不适用于固定细胞。现在Bio-Rad还提供一种VivaFix™活细胞/死细胞染料，适用于活细胞或固定细胞。

优化你的染色操作

抗体的非特异结合可能导致假阳性。通过添加BSA来封闭这些相互作用，可以减少这种非特异的结合。此外，许多细胞（如B细胞、NK细胞和巨噬细胞）在细胞表面有Fcg受体，可与抗体的Fc区域结合，造成非特异的染色。这些可通过添加FcR封闭试剂或使用F(ab)2片段来避免。高的抗体浓度也会增加非特异的结合。因此，抗体浓度应准确测定，以便提高信噪比。使用适当的抗体浓度是多色流式分析的关键。

是否使用同型对照

你可能不想使用同型对照。但是，这样做的前提是你有了其他适当的对照。同型对照与你的抗体有着相同的亚型、相同的荧光基团，来自相同的供应商，在相同浓度下使用。它的目的是确保观察到的染色是由于特异性的抗体结合，从而排除Fcg受体的非特异结合，并排除抗体或荧光基团的非特异结合。

细胞内染色

与细胞表面染色相比，开展细胞内染色可能更具挑战性。在这种情况下，同型对照可能并不合适。建议的做法是使用几个对照，以便更加准确地确定你的阳性群体。其中包括未染色的样品，未表达目的抗原的阴性样品，以及已知的阳性样品。利用市售的试剂（如Leucoperm™），或结合甲醇，或温和去污剂来开展透化的操作。不同的方法可能改善染色，但某些情况下应避免一些结合物（如甲醇不能用于PE）。最后，尽可能避免使用生物素和FITC。内源的生物素需要用链霉亲和素来封闭，而FITC可能带来非特异性的结合。

建立有效的多色分析

当两种荧光基团的发射光谱重叠时，你可能会观察到一种荧光基团渗漏到另一种的检测通道（如FITC和PE）。如果不使用荧光补偿的技术，你可能难以分辨不同的群体。当然，我们最好选择很少或没有重叠的荧光基团，以便最大限度减少这种渗漏。不过，在使用多个荧光基团时，这往往是很难实现的。光谱浏览器可帮助你找到最适合的发射光谱。对细胞亚群的标志物（如T细胞亚群）使用不重叠的荧光基团，或者对相互排斥的标志物（如CD3和CD19）使用重叠的荧光基团，可防止灵敏度降低。

准备适当的对照

对于多色流式分析，单染（single-stained）补偿对照对计算补偿值是至关重要的。补偿值也可以利用多色标记的抗体结合磁珠来确定。最后，流式扣除（fluorescence minus one，FMO）对照可确定荧光扩散，有助于避免灵敏度降低。

了解你的对象

对于那些抗原表达量最低的细胞或最少的亚群，最好使用染色指数最亮的荧光基团（如PE），而对于那些高表达的抗原，稍暗一点的荧光基团可能更适合。不过，在使用多种颜色时，你可能要做一些折中，这取决于荧光基团和抗体的可用情况以及流式细胞仪的配置。串联染料可能使研究更加复杂，因为荧光会渗漏到其他的检测通道。染色指数的表格可以帮助你设计多色分析。

小心对待你的荧光基团

随着颜色的数量不断增加，你将不得不用到串联染料，如PE-Alexa-Fluor 647或APC-Cy7。不过，它们很容易降解，这会导致解偶联以及两个波长下的荧光发射，从而导致假阳性。在固定和透化的过程中，串联染料的亮度可能降低，因此这些步骤应当尽可能温和。补偿值可通过以相同方式处理的样品来获得。