大白菜和甘蓝属于芸薹属蔬菜作物，种植面积和消费量皆居前列，在保证我国蔬菜周年供应、保障人民生活中占有举足轻重的地位。基因编辑是新一代生物育种的关键技术，尽管CRISPR/Cas9基因编辑技术广泛应用于作物的遗传改良，但SpCas9识别的靶序列受到原型间隔序列毗邻基序（PAM）的限制，很难对基因组任意位点实现编辑，因此研究人员一直在尝试打破PAM限制。目前，已经获得识别不同PAM种类的工程化Cas9-NG、SpG和SpRY变体，这些Cas9变体主要在单子叶植物水稻中进行成功应用，能否在芸薹属蔬菜中发挥作用尚不清楚。
近日，河北农业大学
赵建军/李君团队
在
aBIOTECH
上在线发表了题为
“Expanding the targeting scope of CRISPR/Cas9-mediated genome editing by Cas9 variants in Brassica”
的研究论文，显著提高CRISPR/Cas9技术在芸薹属蔬菜中的编辑能力。
本研究首先对大白菜和甘蓝基因组的PAM数量进行分析，发现Cas9-NG/SpG变体在大白菜和甘蓝基因组中潜在靶位点数是SpCas9的两倍多，SpRY几乎可靶向基因组所有位点。随后，构建了植物CRISPR/Cas9-NG、CRISPR/SpG和CRISPR/SpRY基因编辑系统，进而通过大白菜/甘蓝原生质体的瞬时转化体系比较了Cas9-NG、SpG和SpRY变体在不同PAM位点的编辑效率和偏好性。NGS测序结果表明Cas9-NG和SpG可以靶向大白菜/甘蓝NGN PAM，且SpG较Cas9-NG具有更高的编辑效率，更适于NGN位点的编辑；SpRY在NNN PAM位点实现了高效的基因编辑，且在NRN PAM位点的编辑效率高于NYN。SpRY的编辑活性在再生甘蓝株系中得到了进一步验证，表明SpRY能够在芸薹属蔬菜中实现PAM-less的靶向编辑。
在此基础上，将SpRY(D10A)变体与定向进化后的大肠杆菌腺嘌呤脱氨酶（TadA*-8e）融合，开发了SpRY-ABE8e单碱基编辑器。PCR/RE和Sanger测序结果表明SpRY-ABE8e单碱基编辑器对大白菜NNN PAM位点实现了高效的A-to-G替换。该研究开发了适用于芸薹属蔬菜的识别非典型PAM的基因编辑工具盒，有效扩展了SpCas9识别的PAM范围，为芸薹属蔬菜作物品种改良等提供了更广泛、高效、精准的新工具。
图1 利用Cas9-NG, SpG和SpRY变体扩展大白菜和甘蓝的基因编辑范围
河北农业大学生命科学学院博士研究生
李文静
和硕士研究生
李璇
为论文的共同第一作者，
李君
教授、
李岩
副教授和
赵建军
教授为论文的通讯作者，该研究得到国家自然科学基金重点项目、河北省重点研发计划、河北省自然科学基金培育项目和河北农业大学引进人才项目的资助。
引用本文：
Li, W., Li, X., Wang, C. et al. Expanding the targeting scope of CRISPR/Cas9-mediated genome editing by Cas9 variants in
Brassica
. aBIOTECH (2024). https://doi.org/10.1007/s42994-024-00155-7
