肌腱-骨界面能有效传递运动产生的机械应力，但由于其分级结构和成分，它的再生呈现出显著的临床挑战。模仿其独特特征的仿生策略已显示出增强愈合过程的潜力。然而，开发一种能复制肌腱-骨界面纳米结构并嵌入活细胞的复合材料仍然是一个挑战。
来自杭州医学院的 Junjuan Wang等团队
设计了一种嵌入肌腱干细胞的纳米级仿生双层水凝胶，用于肌腱-骨界面的修复。具体来说，这种仿生水凝胶结合了纤维内和纤维外的矿化胶原纤维以及非矿化的胶原纤维，从纳米级别上模拟了肌腱-骨界面的结构。此外，含有细胞的仿生矿化实现了活的类肌腱-骨组织构建。在体内髌骨-髌腱界面损伤模型中，负载肌腱干细胞的仿生水凝胶促进了肌腱-骨界面的再生，表现为纤维软骨形成的增加、运动功能的改善以及生物力学结果的增强。这项研究突出了负载干细胞的仿生水凝胶作为促进肌腱-骨界面再生的有效策略的潜力，为工程复杂组织界面提供了一种新方法。相关工作以题为
“Engineering a stem cell-embedded bilayer hydrogel with biomimetic collagen mineralization for tendon-bone interface healing”
的文章发表在2025年03月10日的期刊
《Bioactive Materials》
。
【仿生矿化胶原水凝胶的特性表征】
为了复制肌腱-骨界面的自然组成，本文开发了一种双层仿生胶原水凝胶，它封装了从非矿化组织到矿化组织的过渡。这种支架的制造过程首先开始于在模具内形成胶原水凝胶，随后是一个三天的矿化阶段，以形成第一层（图1A）。然后，将一层额外的胶原混合物小心地涂抹在模具上，形成第二层胶原水凝胶，最终得到一个双层仿生支架（图1A和B）。
热重分析显示，矿化胶原水凝胶中融入了无机成分，这些成分约占30wt%（图1C）。纳米压痕测试表明，与非矿化胶原水凝胶相比，矿化胶原水凝胶的弹性模量显著增强（图1D）。傅里叶变换红外光谱（FTIR）用于分析非矿化和矿化样品的化学成分。具体来说，在非矿化和矿化样品中都观察到了酰胺I、II和III带，这证实了胶原蛋白的特征吸收峰（图1E）。此外，矿化胶原显示出了独特的峰，这些峰表明存在磷灰石磷酸盐（图1E）。此外，透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）成像用于表征纳米级结构。非矿化胶原显示出典型的条带图案（图1F）。矿化胶原显示出部分矿化的原纤维，其中在纤维内和纤维间都观察到了矿物晶体（图1F）。随机光学重建显微镜（STORM）进一步证实了胶原的纤维内矿化（图1I）。对这些矿化原纤维的选区电子衍射（SAED）分析显示了与（002）和（211）晶面对应的特征宽弧，这与羟基磷灰石的六方晶体形态一致（图1F）。冷冻扫描电镜（Cryo-SEM）成像进一步揭示，非矿化和矿化胶原都具有多孔的纤维结构（图1G）。值得注意的是，非矿化纤维表面光滑，而矿化纤维表面粗糙（图S1）。能谱分析（EDX）矿化样本的剖面确认了基质中存在钙（Ca）和磷（P）（图1H）。
图1 仿生水凝胶的制备和表征
【生物仿生矿化胶原水凝胶的生物学特性】
为制备负载细胞的胶原水凝胶，本文将细胞包埋在胶原水凝胶中，并暴露于矿化培养基或生长培养基中（图2A）。采用活/死细胞染色法评估培养后1、4和7天的细胞活性，结果始终表明水凝胶具有良好的生物相容性（图2B）。嵌入非矿化水凝胶中的细胞呈现纺锤形形态，而在矿化水凝胶中的细胞则表现出更伸展的形态和更多的丝状伪足（图2C）。为了探究矿化对细胞行为的影响，将嵌入水凝胶中的TSPCs用矿化培养基或生长培养基处理3天。随后进行RNA测序分析，以阐明两组之间的基因表达谱差异。主成分分析（PCA）和相关性分析表明，这两组之间存在显著差异（图2D和E）。值得注意的是，在矿化组中，与成骨和成软骨分化相关的基因表达显著上调（图2G）。对矿化组中上调基因进行基因本体（GO）富集分析，结果显示与矿化和软骨形成相关的生物学过程得到富集（图2H）。总体而言，这些结果表明仿生矿化胶原能够诱导TSPCs的软骨内成骨分化，凸显了本文的水凝胶系统在模拟天然肌腱-骨界面方面的潜力。
图2 矿化诱导的生物变化分析
【功能和组织学恢复的评价】
为评估支架对体内肌腱-骨界面修复的影响，本文建立了大鼠髌骨-髌腱界面损伤模型（图3A）。大鼠被随机分配到四组：BC、NMCH、BMCH和BMCH-TSPC。功能恢复是修复的主要目标。为评估运动能力，在手术后2周和4周对大鼠进行了跑步机测试。与其他两组相比，BMCH-TSPC组在两个时间点的跑步距离均显著增加（图3B）。与另外三组相比，最显著的差异出现在第4周（图3B）。在手术后4周，进行了生物力学评估以评估肌腱-骨界面的愈合质量。与BC组相比，BMCH-TSPC组的生物力学性能（包括刚度和弹性模量）显著增强（图3C）。此外，与NMCH组和BC组相比，BMCH-TSPC组表现出较高的最大载荷和拉伸应力（图3C）。综上所述，这些结果表明BMCH-TSPC有效地促进了肌腱-骨界面损伤后的运动功能和机械性质的增强恢复。为了评估恢复后的组织微观结构，本文进行了微计算机断层扫描（micro-CT）和组织学分析。髌骨的micro-CT成像显示，与NMCH组和BC组相比，BMCH-TSPC组和BMCH组在肌腱-骨界面处的新骨再生增强（图3D）。定量分析证实，与NMCH组和BC组相比，BMCH-TSPC组的骨体积与总体积比（BV/TV）显著升高（图3E）。此外，BMCH-TSPC组内的CT密度显著高于其他三组，并且BMCH-TSPC组表现出最低的松质骨间距（Tb.Sp）（图3E）。
图3 载细胞仿生水凝胶促进功能恢复和新骨形成
H&E染色和Masson染色显示，与NMCH组和BC组相比，BMCH-TSPC组的纤维血管组织减少，炎性细胞浸润减少，纤维排列紊乱，且胶原沉积更多（图4A）。此外，在BMCH-TSPC组和BMCH组中观察到大量的软骨细胞（图4A）。不出所料，BMCH-TSPC组的总组织学评分在不同组中是最低的（图4C）。SO-FG染色和TB染色进一步证实了BMCH-TSPC组中纤维软骨的形成，其异染面积与其他三组相比显著增大（图4A和C）。免疫荧光染色显示，BMCH-TSPC组中COL2和SOX9的表达增加，进一步证实了纤维软骨的形成（图4B）。总的来说，这些结果表明BMCH-TSPC具有强大的修复能力，促进了新骨形成和纤维软骨再生，从而增强了体内肌腱-骨界面的恢复。
图4 载细胞仿生水凝胶促进组织学结构恢复
【使用单细胞转录组学分析BMCH-TSPC诱导的修复效果】
为进一步阐明BMCH-TSPC组中再生修复过程的分子机制，采用单细胞转录组测序（scRNA-seq）技术绘制了治疗2周后的细胞亚群图谱。无监督聚类分析鉴定出13个细胞亚群，这些亚群是基于标志物的差异表达来定义的（图5A）。为了分析肌腱-骨细胞谱系，将肌腱细胞和软骨细胞进一步细分为5个亚群（图5B）。TSPCs表达干细胞标志物（如Thy1、Cd44和Pdgfra），并与细胞迁移和再生相关（图5D和E）。CytoTRACE分析预测肌腱干细胞处于较低分化状态（图5C）。肌腱母细胞以经典肌腱标志物（如Tnmd、Thbs4和Postn）为特征，并在细胞外基质合成和伤口反应中富集（图5D）。成纤维细胞表达Fos、Jun和Egr1，这些基因在缺氧和生长因子反应中富集（图5D）。软骨细胞和骨细胞通过典型标志物进行鉴定（图5D）。
图5 BMCH-TSPC组修复后界面组织的scRNA-seq分析
【总结与展望】
本文开发了一种新型的负载干细胞的仿生水凝胶，它是专门为肌腱-骨界面的修复而设计的。这种水凝胶结合了矿化的胶原纤维，这些纤维展现出分级矿化的模式，与自然肌腱-骨界面的超微结构极为相似。结果显示，这种双层仿生矿化水凝胶与肌腱干细胞相结合，有效地促进了纤维软骨和骨骼的再生，从而加速了机械完整性和运动功能的恢复，凸显出其良好的修复效果。总之，本文开发了一种体外类肌腱-骨构建体，它模拟了自然肌腱-骨界面的纳米级结构。这种仿生构建体为肌腱-骨界面的愈合提供了一个有前景的方法。
参考资料：
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2025.03.001
来源：
EngineeringForLife
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