E2F1 诱导的自分泌 IL-6 炎症循环介导癌症免疫串扰，可预测 T细胞表型转换和治疗反应

Naturethink · 公众号 · · 2025-02-26 08:30

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黑色素瘤 是一种发病率越来越高的皮肤癌，一旦达到转移阶段就会发病。一般来说，它被认为是一种免疫原性肿瘤，表达几种肿瘤特异性以及肿瘤相关抗原。已在很大一部分患者中检测到肿瘤特异性 T 细胞反应。此外 ，肿瘤特异性 T 细胞的过继转移可以介导转移性黑色素瘤患者的持久反应。 最近，免疫检查点抑制剂（ICI）彻底改变了晚期黑色素瘤的治疗，在近 50% 的患者中实现了肿瘤消退和持久的癌症控制。这些高缓解率强调了该肿瘤实体的免疫原性。

黑色素瘤病理学中的一个关键表观遗传参与者是 E2F1 转录因子。 除了作为细胞周期、代谢的调节因子或通过诱导细胞凋亡来响应 DNA 损伤的肿瘤监视因子的生理作用外，大量高表达的 E2F1 还刺激黑色素瘤和其他几种肿瘤的转移转化。这种转录因子（TF）通过促进上皮-间充质转化（EMT）、新血管生成、外渗和基因组不稳定来协调转移扩散，预测疾病恶化和不良患者预后。

为了探索 E2F1 在侵袭性黑色素瘤细胞存在下的免疫调节中的作用 ，德国罗斯托克大学医学中心及埃尔朗根-纽伦堡大学肿瘤免疫学实验室 研究团队在一项实验中 建立了一个共培养系统，并利用转录组和细胞因子阵列结合生物信息学和结构建模，确定了一个以 IL6 为中心枢纽的 E2F1 依赖性基因调控网络。 研究成果发表于 Frontiers in Immunology 期刊题为“ E2F1-induced autocrine IL-6 inflammatory loop mediates cancer-immune crosstalk that predicts T cell phenotype switching and therapeutic responsiveness ”。

首先，为了进行基因表达分析，使用人类黑色素瘤组织培养模型，该模型由具有特征性侵袭/转移潜力的不同细胞系组成，这些细胞系显示 E2F1 水平与细胞运动呈正相关 （图1 B）。在侵袭性细胞系中敲低 E2F1 后，揭示了 3687 个显著差异表达基因（DEGs）（图1 C）。在 DEGs 上应用 GSEA 表明， 在黑色素瘤中敲低 E2F1 后，EMT 和炎症反应的基因集受到抑制（图1 D），这意味着 E2F1 调控基因的多效性结合了其促转移和免疫调节活性。 值得注意的是， 在比较来自两个标志集的富集基因后，IL6 成为唯一的候选基因 （图1 E）。

将来自 Transfac 和免疫相关基因的列表与转录组数据相结合，确定了 165 个显著下调的基因，这些基因可能对免疫调节有影响（图1 F）。对已鉴定基因的 STRING 分析表明，存在高度互连的网络，包括 E2F1、MYC、CD274（PD-L1）、EZH2 和 IL6（图1 G）。有趣的是，IL6 在 E2F1 消融后表现出最强烈的下降（图1 C），在与细胞因子介导的信号传导、Th2 细胞因子产生和细胞迁移调控相关的基因表达亚簇中占据中心枢纽位置（图1 H）。这些数据支持，E2F1 与免疫调节之间的功能联系，并强烈表明 IL-6 是该转录因子发挥免疫调节活性的关键因子。随后对 IL-6 表达和分泌的分析清楚地验证了其与内源性 E2F1 表达的正相关（图1 I）。进一步检测侵袭性黑色素瘤细胞中 E2F1 和 IL-6 以及间充质或上皮细胞标志物的表达，并分析它们的相关性（图1 J-L）， 发现 IL-6 通过增强黑色素瘤细胞的 EMT 和侵袭性来促进 E2F1 诱导的转移。

为了进一步评估 IL6 的转录调控，使用 ChIP-seq 数据筛选 IL6 基因上游 10,000 bp 的片段来搜索 E2F1 结合簇，并在翻译起始位点近端的转录活性区域中心发现了一个主要的 E2F1 簇。值得注意的是，该区域还包含一个 STAT3 簇。据报道，STAT3 和 E2F1 可以根据细胞环境产生转录协同作用， 研究结果也证实了 E2F1 和 STAT3 对 IL6 启动子的协同增强作用。

图1 转移性黑色素瘤中鉴定 E2F1 诱导的免疫调节网络。

由于 E2F1 通过 IL-6 协调免疫调节网络（图1 G），因此，接下来研究了 IL-6 对癌症免疫串扰的影响，建立一个间接共培养系统，将高表达 E2F1 与 E2F1敲低（E2F1-KD）黑色素瘤细胞系以单一培养的形式或与来自健康供体的 CD4 + 或 CD8 + T 细胞共培养（图2 A）。通过活/死染色验证共培养的黑色素瘤和免疫细胞的活力（图2 B）。

与单一培养的 CD8+（左图）或 CD4+（右图）T 细胞相比，转移性黑色素瘤细胞在上清液中显示出高浓度的 IL-6（图2 C）。 重要的是，当肿瘤细胞和免疫细胞一起培养时，IL-6 水平显著增加，这表明黑色素瘤和 T 细胞之间存在正反馈回路。 尽管 E2F1 的缺失主要抵消了这种作用，但 IL-6 在共培养条件下仍然可以检测到，并且只能通过直接抑制来降低。事实上，在 T 细胞存在的情况下，联合IL-6 抑制剂和 E2F1-KD 处理以降低升高的细胞因子水平是必要的（图2 C），而不影响细胞活力。

由于 E2F1 对肿瘤细胞中 GRNs 的影响以及观察到的 IL-6 分泌的有趣变化，研究人员想知道黑色素瘤和 T 细胞的基因表达谱在多大程度上发生了改变，以及 E2F1-KD 是否可以在抗肿瘤免疫反应的意义上对 T 细胞的基因组程序产生积极影响。因此，对来自单培养和共培养实验的肿瘤和免疫细胞进行了高通量阵列分析（图2 A）。

来自共培养的 CD4 + T 细胞和人皮肤黑色素瘤细胞系 SK-Mel-147 对照与其相应的单一培养物的转录组的比较显示，总共有 9453 个和 4521 个 DEGs（图2 D），表明通过细胞因子介导的串扰，在富含 E2F1 的黑色素瘤和免疫细胞中强烈地诱导转录变化。 值得注意的是，在共培养条件下，IL6 在黑色素瘤细胞中表达最强烈（图2 D），这也验证了图中检测到的 IL-6 分泌增加，并支持存在活性反馈回路。 E2F1 敲低将两种细胞类型中基因表达的这些变化严重分降低到 1462（CD4+）和 1708（SK-Mel-47 E2F1-KD）DEGs（图2 E），强调了 E2F1 在肿瘤和免疫细胞之间的串扰中的调节作用。

为了进一步研究已鉴定基因的潜在生物学功能，对 DEGs（图2 D）进行了 GO 富集分析，发现与 SK-Mel-147 共培养的 CD4+ 中，1315 个上调基因主要与 T 细胞活化和 MHC-II 相关反应增加（即抗原加工和呈递）等过程和通路相关（图2 F），表明 T 细胞功能。 相比之下，1662 个下调基因与单核细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的趋化性有关（图2 F），表明与先天免疫细胞的定向通讯受损 。重要的是， 该分析还揭示了与 IFN-γ 和 TNF-α 反应相关的基因抑制，这是已知可促进抗肿瘤反应的 CD4+ Th1 分化的两个关键介质。 这与与 Th1 发育相关的 ERK1/ERK2 通路相关基因的抑制一致（图2 F）。在黑色素瘤细胞中，发现 331 个上调基因的抗原加工/呈递和免疫反应的正调节得分很高（图2 G），这与黑色素瘤的高度活跃免疫表型一致，而下调的基因主要参与神经元过程（图2 G）。令人惊讶的是，在上调的免疫激活基因中，发现了几种免疫抑制因子，如 CCL2，一种有效的 Th2 细胞趋化剂，以及检查点抑制剂 CD274（图2 G），如图1 G 所示，它通过 IL6 簇连接到已识别的免疫调节 E2F1 网络。

图2 E2F1 依赖性串扰对黑色素瘤和 CD4 + T 细胞转录的影响。

考虑到 E2F1 通过 IL-6 的大幅上调和转录水平的变化对周围环境的影响，使用 TIMER 2.0 数据库分析了原发性和转移性皮肤癌中 E2F1 的表达与免疫细胞肿瘤浸润之间的潜在相关性。基于功能注释和通路富集（图2 F ），首先研究了单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的丰度。有趣的是，发现 E2F1 与原发性和转移性患者样本中的单核细胞呈有限的负相关（图3 A、B）。然而，在两个癌症组中都没有明显的中性粒细胞或嗜酸性粒细胞的存在，证实了实验之前的发现，即这些免疫细胞类型的趋化性相关基因下调（图2 E）。

更重要的是， 这些数据显然支持 E2F1 及其靶点 IL-6 对 Th1/Th2 发育的强烈影响， 如 Th2 细胞因子的产生、ERK1/2 通路的下调、IFN-γ反应或 CCL2 在黑色素瘤细胞中的表达。 令人惊讶的是，E2F1 与原发肿瘤中的 Th2 浸润呈显著的正相关，而 IL6 没有影响 （图3 C）。相比之下，转移性样本仅与 Th2 细胞表现出中等相关性，但也与 Th1 相关，这可能支持免疫刺激和免疫抑制机制的共现。然而，IL6 可以进一步促进 Th2，如晚期黑色素瘤中 Th2 丰度的增加和随之而来的 Th1 细胞减少所表明的那样（图3 C）。这种转变通过 E2F1 的辅因子 STAT3 的表达进一步放大，该辅因子 STAT3 持续抑制 Th1。此外，CD274 在原发性和转移性肿瘤中同时阻断 Th1 并促进 Th2 浸润（图3 D）。

为了验证 E2F1 依赖性 Th2 转移，使用从黑色素瘤免疫细胞共培养中获得的上清液进行细胞因子阵列，特别关注 1 型和 2 型细胞因子（图3 E、F）， 发现 CD4+-SK-Mel-147 共培养的上清液显示所有检测到的 2 型细胞因子显著增加，其中 IL-6 表现出最强的反应 。引人注目的是，E2F1 的缺失导致大多数促炎蛋白的显著减少，但不影响 1 型细胞因子（图3 F）。与之前的数据一致，在高表达 E2F1 黑色素瘤共培养物中测得的 IL-6 水平急剧升高（图3 E）在 E2F1-KD 下显著降低（图3 F）。 这些结果提供了强有力的证据，表明 E2F1/IL-6 表达增加通过 2 型细胞因子触发 Th2 驱动的炎症，而 Th1 细胞活性受到抑制，建立了免疫抑制环境。

图3 E2F1 对与 T 细胞共培养中免疫细胞浸润和细胞因子释放的影响。

由上述结果可知，STAT3 与 E2F1 共同参与 IL-6 表达，对黑色素瘤患者的 Th2/Th1 平衡起着关键作用。为了验证分子机制和癌症免疫串扰的动力学，研究人员最终推导出了一个基于核心肿瘤-免疫相互作用网络的数学常微分方程（ODE）模型， 该模型描述了 E2F1-STAT3/IL-6/IL6R 信号通路的激活以及 E2F1 和 STAT3 之间相互作用对 IL-6 转录调控的影响 （自体和旁分泌激活；图4 A ）。通过修改E2F1表达值的迭代模拟发现，在基础 STAT3 激活下，黑色素瘤细胞中 E2F1 水平的增加可以触发 IL-6 的表达和分泌（图4 B）。模拟表明，黑色素瘤细胞高水平的 IL-6 分泌可以通过高水平的 E2F1、高水平的 STAT3 或中等水平的两种 TFs 来实现（图4 C）。

此外，还模拟了黑色素瘤分泌的 IL-6 对 TME 中存在的 CD4 + T 细胞的影响（图4 A），表明高表达 E2F1 黑色素瘤细胞分泌的 IL-6 足以触发 CD4+ 免疫细胞中 IL-6/IL6R/STAT3 轴的激活，这也可能触发其他炎症因子的分泌。重要的是，该模型在 IL-6 介导的自分泌激活诱导的 CD4+ 反应中显示出超敏感性，因此能够对患者数据进行以治疗为导向的解释。

图4 黑色素瘤-CD4 + T 细胞与 E2F1-STAT3/IL-6/IL6R 轴串扰的数学模型和概述。

总之，该研究确定了一个以 IL6 为中心枢纽的 E2F1 依赖性基因调控网络。E2F1 诱导的 IL-6 分泌释放出自分泌炎症反馈回路，驱动侵袭和上皮间质转化。IL-6 激活的 STAT3 与 E2F1 物理相互作用，并通过结合 E2F1-STAT3 响应性启动子元件协同增强 IL-6 表达。引人注目的是，E2F1 缺失减少了典型 2 型细胞因子的分泌，从而启动了 Th2 到 Th1 表型向抗肿瘤免疫反应的转变。这项研究解决了肿瘤相关微环境在调节免疫反应中的重要分子影响，并将为改进未来的癌症治疗做出重大贡献。

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参考文献：Spitschak A, Dhar P, Singh KP, Casalegno Garduño R, Gupta SK, Vera J, Musella L, Murr N, Stoll A, Pützer BM. E2F1-induced autocrine IL-6 inflammatory loop mediates cancer-immune crosstalk that predicts T cell phenotype switching and therapeutic responsiveness. Front Immunol. 2024 Oct 31;15:1470368. doi: 10.3389/fimmu.2024.1470368. PMID: 39544930; PMCID: PMC11560763.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39544930/ 或点击下方阅读原文

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