专栏名称: 生信图书馆

深入解读最新生信文献，分享研究思路和方法，提供专业生信分析服务，帮助您把握生物信息学的最新动态

卷的不行的肿瘤生信挖掘！CAR-T疗法+代谢组学角度出发开辟一片新天地！了解它、学会它、研究它，一区SCI，拿捏~

生信图书馆 · 公众号 · · 2024-08-13 19:00

正文

免疫遗传揭示了调节CAR-T细胞代谢和功能的关键酶

哈喽哈喽宝宝们，馆长又来啦！是不是有的宝宝已经进入假期啦！在休息放松过后，也不要忘记学习哦！学无止境，阅读文献了解前沿不能停！

今天馆长给大家带来的这一篇是来自于美国耶鲁大学的一篇研究，于2023年8月发表于Cancer Immunology Research。相信有很多宝宝们的课题都涉及到免疫方面吧，于是馆长呢偶然看到了这篇文献，就想立马和宝宝们分享！这篇文献涉及到了目前临床上一种非常有前景的治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，CAR T疗法，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。

1. 本研究数据揭示了直接在CAR T细胞中代谢重编程的系统知识，并揭示了改善CAR T细胞疗法的潜在靶点。

2. 本研究使用多组学方法鉴定并分析了ADA和PDK1作为人原代T细胞和CAR T细胞中的关键代谢酶，并通过表性分析验证，最终强调了这些酶在代谢和T细胞功能中的作用，这对癌症免疫治疗和细胞治疗至关重要。

PS：免疫疗法一直是大热方向，CAR T疗法如今更是炙手可热。如果你有兴趣想要了解一下前沿但不知道如何入手，那就来扫码联系馆长吧！馆长这里有无数高分文章套路可复现，也有相应的技术支持哦!

定制生信分析

云服务器租赁

加好友备注“99” 领取试用

题目：免疫遗传学代谢组学揭示了调节CAR T细胞代谢和功能的关键酶

杂志：Cancer Immunology Research

影响因子：IF=8.1

发表时间：2023年8月

公众号回复“666”领取原文PDF，文献编号：240813

研究背景

免疫逃避是癌症进展的关键步骤，这仍然是当前基于T细胞的免疫疗法的主要障碍。而常见的肿瘤内在逃避机制包括癌细胞通过产生代谢不利的肿瘤微环境（TME）来抑制 T 细胞功能，因此人们思考是否有可能对T细胞进行基因重编程。目前，对 T 细胞代谢和嵌合抗原受体（CAR） T 细胞代谢的认识仍存在巨大差距。嵌合抗原受体（CAR） T 细胞是患者来源的 T 细胞，其经过重新编程以靶向特定癌症抗原，并作为免疫疗法重新引入患者体内。但由于高度工程化的 CAR 和受体诱导的不同的T 细胞信号转导，CAR T 细胞的代谢可能有所不同。因此，本研究通过多组学分析，着重在代谢方向分析CAR T发挥的功能及机制，旨在找出关键代谢基因并为免疫疗法和细胞疗法提供新见解。

研究思路

首先作者开发了一种多步骤合理化的选择过程，以确定一组有前途的候选基因作为代谢重编程 T 细胞的遗传靶点，最终从572个基因中选取了两个基因分别为ADA和PDK1。然后作者通过CRISPR-Cas9技术将ADA和PDK1敲除或过表达到人CD8 T细胞中以评估 ADA 和 PDK1 如何影响 CD8 T 细胞的功能。为了进一步揭示ADA和PDK1表达改变的影响，作者依次进行了转录组学和代谢组学分析，找到了相关富集通路并进行相关功能验证。此外，作者还测试了ADA和PDK1对CD19 CAR T细胞的细胞毒性和存活率的影响，以证明过表达 ADA 或 PDK1 会导致癌细胞细胞溶解增强。为了确定 ADA 和 PDK1 的调节如何影响 CAR T 细胞，作者再次与匹配的 CD19 特异性 CD8 CAR T 细胞对照，探究ADA-OE 和 PDK1-OE CAR-T 细胞的转录组学和代谢组学的变化，并寻找相关功能通路并进行验证。最终探究出相关代谢酶在CAR T中的功能作用，为免疫疗法提出新见解。

研究结果

1. 利用人类疾病数据库和代谢途径分析鉴定出CD8 T细胞的候选代谢调节因子

为了确定一组有前途的候选基因作为代谢重编程T细胞的遗传靶标，作者开发了一个多步骤的合理化和选择过程（图1 A），从572个在T细胞功能中具有潜在作用的基因构建了一个候选列表，然后依次过滤候选基因列表，最终筛选出两个基因：ADA 和 PDK1。为了评估 ADA 和 PDK1 如何影响 CD8 T 细胞的功能，作者利用CRISPR技术构建过表达和敲低突变体并转入CD8 T 细胞中表达（图1 B）.基于基于Nextera的扩增子捕获，在突变体中观察到了高效的基因编辑，通过 Welch t 检验基因编辑的效率（图 C-D）。为了揭示 ADA 和 PDK1 表达改变的影响，对每种 CD8 T 细胞突变体进行转录组学分析（图1 E-I），其结果表明ADA 和 PDK1 突变体 CD8 T 细胞显示出广泛的转录组学改变。

图1：计算机筛选和 mRNA-seq 显示 ADA 和 PDK1 是代谢重编程基因，可诱导原代人 CD8 T 细胞中与免疫反应相关的转录组变化。

2.ADA 和 PDK1 突变体 CD8 T 细胞显示出广泛的代谢组学改变

为了进一步了解 ADA 和 PDK1 突变对 CD8 T 细胞的代谢影响，作者进行了代谢组学分析（图2）。首先显示了ADA和PDK1 T细胞突变体中不同代谢物水平的热图分析（图2 A-B），找到其发生显著变化的相关代谢物。然后对其进行代谢通路分析（MetPA，MetaboAnalyst v4.0），找到其相关富集通路（图2 C-D）。其结果表明，在原代人CD8 T细胞中， ADA 通过嘌呤生物合成途径调节代谢，并影响效应功能基因，包括 TNFAs，IFNG ，颗粒酶和 PRF1 。相比之下， PDK1 水平影响了广泛的代谢途径，最显著的是谷氨酰胺分解、谷胱甘肽生物合成和TCA循环。然后对 ADA 和 PDK1 T 细胞突变体中的功能标志物进行流式细胞术分析（图2 E-F），观察相关细胞毒性标志物和耗竭标志物的表达情况。

图2：ADA 和 PDK1 突变原代人 CD8 T 细胞的代谢重编程。

3.ADA和PDK1调节可提高 CD8 CAR T 细胞的细胞毒性和存活率

由于调节ADA和PDK1的表达对T细胞代谢、细胞毒性和存活基因表达有很强的影响。然后作者通过T细胞和同源癌细胞的共培养来测试细胞毒性测定来测试这些功能属性（图3）。作者首先通过使用具有 CD19 特异性 CAR 的慢病毒载体生成 CAR T 细胞（图3 A），然后通过流式进行纯度分选（图3 B）。随后，通过CRISPR法突变并进行验证（图3 C-E）。然后通过荧光素酶实验以测定不同种CAR T细胞的毒性（图3 F-G）其结果表明，过表达 ADA 或 PDK1 会导致 CD19 特异性 CAR T 细胞的癌细胞溶解增强，并且ADA-OE总体杀伤力最高，能够通过降低细胞外Ado水平来增加癌症杀伤力。

图3：ADA 或 PDK1 在原代人 CD8 CD19 特异性 CAR T 细胞中的过表达会增强细胞毒性。

4.ADA-OE 和 PDK1-OE CAR-T 细胞的转录组学和代谢组学改变

为了确定 ADA 和 PDK1 的调节如何影响 CAR 系统的 T 细胞，作者对不同的 CAR 突变体进行了转录谱与代谢组分析，筛选其与免疫相关条目（图4 A-E）。然后作者以同样的方式分析了PDK1的转录组学和代谢组学变化（图5），筛选出相关条目并进行后续的分析验证。相关

图4：ADA 突变原代人 CD8 CAR T 细胞的多组学分析和表型表征。

图5：PDK1突变原代人CAR T细胞的多组学分析和表型表征

5.ADA的过表达会增加细胞毒性和记忆力，同时减少CAR T细胞的耗竭

为了进一步探索ADA-OE CAR T细胞如何增强癌症杀伤，作者进行了细胞表型分析（图6）。使用流式细胞术分析相关效应分子的表达（图6 A）以及NALM6-GL 细胞死亡情况（图6 B），并基于CellTrace Violet的测定，测定细胞增殖与分裂情况（图6 C）。此外，还利用流式细胞术分析A2AR-PKA 信号转导的记忆、耗竭和下游靶标的耗竭情况，并绘制出总体信号通路示意图（图6 D-F）。

图6：ADA-OE 原代人 CD8 CAR T 细胞的表型分析。

6. ADA 过表达增加结直肠癌体内模型中 HER2 特异性 CAR T 细胞功能

作者同样测试了由异质 CD3 T 细胞群产生的 HER2 特异性 CAR T 细胞中的 ADA-OE 在体内实体瘤模型中是否有效。首先，作者使用 Cas9-RNP构建慢病毒载体（图7 A），然后建立体内HT29-GFP-荧光素酶（HT29-GL）肿瘤模型，其结果表明了与对照CAR T细胞和WT T细胞相比，ADA-OE CAR T细胞组显示出更强的抗肿瘤功效（图7 B）。对肿瘤进行提取和分析，结果显示ADA-OE增加了CAR T细胞浸润和CD8/CD4 CAR T细胞比例，以及CD4和CD8 T细胞群的增殖率和中枢记忆极化（图7 C-E）。这些结果表明，ADA-OE在体外提高了HER2特异性CAR T细胞的性能，并显著提高了HER2特异性CAR T细胞治疗在体内结直肠癌模型中的抗肿瘤疗效。

图7：ADA-OE 增强体内结直肠癌模型中 HER2 特异性原代人 CD3 CAR T 细胞功能。

文章小结

在这项研究中，作者使用多组学方法鉴定并分析了ADA和PDK1作为人原代T细胞和CAR T细胞中的关键代谢酶。研究表明，ADA 过表达改善了来自不同供体的 CD19 特异性和 HER2 特异性 CAR T 细胞的功能，并通过增强癌症裂解、CAR T 细胞增殖和中枢记忆生成以及减少耗竭来评估。此外，研究表明，ADA-OE显着提高了体内实体瘤模型中HER2特异性CAR T细胞的疗效。这些发现强调了这些酶在代谢和T细胞功能中的作用，这对癌症免疫治疗和细胞治疗至关重要。读完这篇文献，宝子们知道CAR T可以怎么做了吗？功能分析和多组学分析结合简直YYDS!想不想进一步了解一下？来找馆长吧，馆长可以尽力给你提供各种信息哦!

馆长有话说

馆长会持续为大家带来最新生信思路，也可以提供特色数据库构建、免费思路评估、付费生信分析和方案设计以及实验项目实施等服务，对数据库构建和生信分析感兴趣的朋友可以咨询馆长哦！

卷的不行的肿瘤生信挖掘！CAR-T疗法+代谢组学角度出发开辟一片新天地！了解它、学会它、研究它，一区SCI，拿捏~

正文

请到「今天看啥」查看全文