酶免疫分析技术是以酶标记的抗原(抗体)作为主要试剂，将抗化反应的专一性、敏感性相结合，检原抗体反应的特异性与酶高效催测样本中相应的抗体(抗原)的一种免疫检测技术。基本原理是将某上，使这种酶标记的抗原(抗体)既种酶结合到特异性抗原(抗体)保留酶对底物的催化活性，又保留抗原与抗体的免疫学活性，当酶标记的抗原(抗体)与相应抗体抗原)反应后，通过酶对底物的显色反应来对抗体或抗原进行定性、”定位或定量分析。
作为一种经典的免疫标记技术，酶免疫分析技术具有灵敏度高、特异性强、准确性好、酶标志物有效期长、试剂价格低廉、操作简便等优点。近年来，随着单克隆抗体技术、化学发光技术、生物素-亲和素技术等相关技术的发展，酶免疫分析技术不断改进与更新，灵敏度、特异性和自动化程度得到进一步提升，在医学和生物学领域的应用也日益广泛。
根据实际应用目的不同，酶免疫分析技术可分为以下2类。
1.酶免疫组织化学技术
主要用于组织切片或其他标本中抗原成分的定位分析。
2.酶免疫测定技术
主要用于液体标本中抗原(抗体)的定性或定量检测。根据反应过程中是否需要将结合的酶标志物和游离的酶标志物分离，又分为均相酶免疫测定和非均相(或异相)酶免疫测定2种类型。均相酶免疫测定主要包括酶放大免疫测定技术和克隆酶供体免疫测定技术。根据是否采用固相材料吸附抗原或抗体，非均相酶免疫测定又可分为液相酶免疫测定和固相酶免疫测定两类，固相酶免疫测定中具代表性的是酶联免疫吸附试验。
ELISA无疑是酶免疫测定技术中最经典的方法，这么多年，虽然被大家嫌弃，操作繁琐，这个那个的，依然被称为免疫学经典方法。
今天不谈ELISA，我们谈谈固相膜免疫技术中的几种免疫学方法。
固相膜免疫技术是以微孔滤膜作为固相载体的免疫测定技术。常用的固相膜为硝酸纤维素膜(NC膜)。
(一)斑点酶免疫吸附试验
斑点酶免疫吸附试验(dot enzyme linkedimmunosorbent assay,Dot-ELISA)的试验原理与ELISA相同
。不同之处在于，斑点酶免疫吸附试验使用吸附蛋白质能力很强的硝酸纤维素膜为固相载体，酶催化底物形成不溶性有色沉淀物沉积在硝酸纤维素膜上，使硝酸纤维素膜染色。以间接法检测抗体为例，具体操作是:①加少量抗原于膜上，干燥后用封闭液进行封闭;②滴加待检标本，标本中待测抗体与膜上的抗原特异性结合，洗涤;③滴加酶标二抗，形成抗原-抗体-酶标抗复合物;④最后滴加底物溶液，硝酸纤维素膜上出现肉眼可见的有色斑点即为阳性。
蛋白能力强，微量抗原或抗体即可Dot-ELISA的优点:NC膜吸附吸附完全，故敏感性较普通ELISA高6~8倍。如将NC膜裁剪成膜条，并在同一张膜条上点有多种抗原将整个膜条与同一份血清反应，则可同时获得对多种抗体的检测结果试剂用量小，较ELISA节约5~10倍。试验和结果判断不需特殊设备条件。吸附有抗原或抗体的NC膜及缺点是操作麻烦，特别膜上的结果均可长期保存(-20℃C可达半年)。是洗涤很不方便。只能用于定性检查，不能用作定量检测。
（二）酶免疫渗滤试验
酶免疫渗滤试验（immunoenzyme filtration assay，IEFA）是在
Dot-ELISA的基础上发展建立的，该法以NC膜为固相载体，抗原抗体反应和洗涤在微孔滤膜上以渗滤的方式进行。
试验中用到的渗滤装置由塑料小盒、NC膜（点加了抗原或抗体）和吸水纸所组成，所有反应过程均在此渗滤装置上进行，其原理和操作与ELISA基本相同。以双抗体夹心法测h CG为例，具体操作是：①在小孔内加待测标本，待渗入，如标本中有hCG，则与NC膜上的抗hCG结合，洗涤；②加酶标抗体，形成抗h CG-h CG-酶标抗hCG复合物；③滴加底物，膜上出现有
色斑点即为阳性。
IEFA的优点:操作简便快速，结果易于观察，敏感性和特异性高。在此基础上发展建立的斑点金免疫渗滤试验以胶体金代替酶作为标志物，省略了酶对底物的催化反应，更加简便快速。
(三)免疫印迹试验
免疫印迹试验又称酶联免疫电转移印迹法或蛋白质印迹
。它是一种凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的高特异性、敏感性相结合的技术，即将电泳区分的蛋白质转移至固相载体，借助酶免疫、放射免疫等技术测定OIBT分3步:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电转移和酶免疫定位。具体方法:①将待检品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，待检品中蛋白质的不同抗原组分因分子质量和电荷的不同而分开，得到不同区带(此时因未染色肉眼不可见);②通过转移电泳(100V，1~2A，通电45min)将各区带上的抗原原位转移至NC膜上(相当于在固相载体上包被抗原);③先后加入特异性抗体和酶标二抗，形成抗原-抗体-酶标二抗复合物，加入底物经酶催化形成不溶性有色产物，使区带染色。阳性反应的条带染色清晰，并可根据SDSPAGE时加入的分子质量标准，确定各组分的分子质量。
免疫印迹试验能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子质量，常用于多种病毒抗原或抗体的检测。例如，检测HIV抗体用于确定HIV感染。在成品试剂盒中，厂家已完成前两个步，检测时只需进行第二步即可，非常方便。
免疫印迹法，作为HIV病毒抗体确认试验而荣耀加身。然而欲戴王冠，必承其重，也因为如此它才承受了太多不该承受的，这些年对于免疫印迹法作为HIV病毒抗体确认试验并没有办法完全确认，要求检测RNA的呼声很大。
(四)重组免疫结合试验
重组免疫结合试验(recombinantimmunlbindingassay，RIBA)与免疫印迹法相似，不同之处在于特异性抗原不通过电泳分离转印，而是直接分条加在固相膜上。
RIBA已用于血清中抗HCV抗体的检测与分析。HCV抗原成分较复杂，包括特异性的非结构区抗原、结构区抗原、核心抗原和非特异性的G抗原。在ELISA中通常是使用混合抗原包被，检测到的血清抗体也是混合性的。而RIBA将各种抗原成分以横线条形式分别吸附在硝酸纤维素膜上，放于特制的长条凹槽反应盘中与标本(一抗)和酶标抗抗体(二抗)温育和洗涤，最终加底物显色，显色条带提示血清中存在相对应这一吸附抗原的特异性抗体。根据条带的粗细和显色深浅，还可粗略估计抗体效价。
RIBA非常适合于含复杂抗原成分的病原体抗体的分析，除抗HCV外，也成功地用于抗HIV抗体的检测。
今天重点介绍下最后一种方法学，主要是因为最近接触了复星诊断的一款检测结核分枝杆菌的仪器。
别人问我这产品如何，优劣势，这就回到了文章的最开头，看起来熟悉，实际上并不了解，也就ELISA相对了解，这方法并不熟悉，所以这不就翻书学习学习。
什么是IGRA？什么是ELISPOT?
（五）酶联免疫斑点试验
体外检测特异性抗体分泌B细胞和细胞因子分泌T细胞的酶联免疫斑点试验（ELISPOT）。
酶免疫斑点试验(ELISPOT):活化的淋巴细胞分泌细胞因子,在孵育过程中可被包被有特异性细胞因子抗体的培养板捕获,将细胞和过量的细胞因子去除后,加入酶标的二抗,孵育后洗去多余二抗,加入酶的底物,作用后经显色形成不溶的颜色产物即斑点。
每个斑点是激活的淋巴细胞分泌的细胞因子区域,代表一个活性淋巴细胞。该方法可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力及计数特异性抗原刺激下分泌淋巴细胞产生的情况。可应用酶联斑点图像分析仪(ELISPOTREADER)对实验结果进行自动化分析。
1.ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。
2.ELISPOT通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。
3.由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从20万～30万个细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。
4.捕获抗体为高亲和力、高特异性和低内毒素McAb，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。
γ-千扰素释放试验(inlereron-y release assay,IGRA)是检测结核分枝杆菌(Mycobcheriumlubercalosis,MTB)特异性抗原刺激T细胞产生的
γ-干扰素(IFN-y),以判断是否存在 MTB 感染
。IGRA适应证主要包括结核潜伏感染(Ialenlluberc:ulosis infec:lion,LTBI)的诊断和活动性结核
aclive luberc:ulosis,ATB)的辅助诊断,
与结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test,TsT)相比具有明显优势:特异度高,不受卡介苗接种及大多数非结核分枝杆菌(nonluberc:ulous myc:obac:leria,NTM)的干扰
;使用单一阈值作为阳性判断标准;作为体外诊断方法,更适用于疫情检测和流行病学调查。IGRA作为世界卫生组织(world healh organizalion,WIIO)推荐的用于诊断WTB感染的体外免疫学方法，
2017年我国肺结核诊断行业标准(WS288-2017)增加了IGRA作为免疫学检查的手段。
既然提到行业标准，那么我们就来看看。
再回到上面《结核分枝杆菌γ-干扰素释放试验及临床应用专家意见（2021年版）》的文章中，我们再来看改文章中如何介绍这个问题：
ELISPOT如何应用?
说得挺委婉的，用词也很谨慎，“合适”的免疫学方法，“相比较”ELISA，我相信你没收钱。哈哈哈！
ELISPOT使用外周血以外
标本类型，需要验证，在没有摸索出可靠的实验条件的情况下，同时检测只作为补充之用。这文章，确实够谨慎。
ELISPOT使用外周血以外
标本类型，基本上同胸腔积液，且对于脑脊液等标本分离淋巴数量不足缺乏统一的操作流程和判断，只能起到辅助性作用。
这就是为什么所有文章都要标注“无利益相关”，类似于罗尔斯提出的“无知之幕”，抛开所有立场，只把理性思维摆在第一位，才能得出无限接近于真相的文章。而不是一天到晚，瞎几把吹。
