原名： Selenium polysaccharide form sweet corn cob mediated hypoglycemic effects in vitro and untargeted metabolomics study on type 2 diabetes

译名： 硒化甜玉米芯多糖介导的2型糖尿病的体外及非靶向代谢组学研究

期刊： International Journal of Biological Macromolecules

IF： 7.7

发表时间： 2024.10

通讯作者： 王鑫

通讯作者单位： 哈尔滨商业大学

α-淀粉酶的抑制作用（图1（A））随着样品浓度的增加而增加。阿卡波糖、SeSCP和SCP对α-淀粉酶的IC ₅₀ 分别为0.751、1.32和2.11mg/mL。α-葡萄糖苷酶的抑制作用（图1（B））随着样品浓度的增加而增加。阿卡波糖、SeSCP和SCP对α-葡萄糖苷酶的IC ₅₀ 分别为0.216、0.277和0.402 mg/mL。SCP与硒的结合增强了α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的酶浓度与样品反应速率之间的关系如图1C-F所示。随着SeSCP和SCP浓度的增加，反应速率降低，所有直线都穿过原点，表明SeSCP和SCP对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制是可逆的，SeSCP和SCP能够暂时灭活酶而不影响酶的结构。样品对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk双倒数图如图1G-J所示。所有曲线都通过Y轴上的同一点；此外，K _m ^app 的值随着样品浓度的增加而增加，而V _max 保持不变。这些发现表明，SeSCP和SCP对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制是竞争性的，SeSCP与SCP与底物竞争酶的结合位点，从而减少了酶对底物的降解。为了比较抑制作用，我们通过绘制基于K _m ^app 的样品浓度的曲线并计算截距和斜率比来获得Ki。SeSCP和SCP对α-淀粉酶的K _m ^app 值分别为8.084、5.656、3.895、2.152和1.592，5.308、4.098、2.723、1.896和1.592（分别对应于4、2、1、0.5和0 mg/mL的浓度）。SeSCP和SCP对α-葡萄糖苷酶的K _m ^app 值分别为4.167、3.351、2.722、1.782和0.263以及2.399、1.830、0.988、0.498和0.263（分别对应于4、2、1、0.5和0 mg/mL的浓度）。SeSCP和SCP对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的K _i 值分别为0.855±0.016、1.605±0.008 mg/mL和0.344±0.002、0.424±0.008 mg/mL，K _i 值越小，抑制作用越强。这些结果表明，SeSCP对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用是竞争性可逆的，这意味着SeSCP能够暂时结合到α-淀粉酶的结合位点，从而防止底物被α-淀粉酶或α-葡萄糖苷酶分解。这些结果还表明，SeSCP对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用优于SCP。

荧光淬灭的结果如图2A-G所示。我们发现α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶在357nm和338nm处具有最强的荧光强度，荧光强度随着SeSCP浓度的增加而降低，这表明SeSCP与这两种酶相互作用。在298、304和310 K下，SeSCP对α-淀粉酶影响的K _sv 值分别为16.876、13.528和10.820 L/g，对α-葡萄糖苷酶影响的K _sv 值分别为35.637、26.023和20.736 L/g。K _sv 随温度升高而降低，表明SeSCP对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的淬灭机制涉及静态淬灭，SeSCP通过与α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶结合降低了荧光强度。与K _a 、n、ΔH、ΔS和ΔG相关的结果如表1所示。我们以log[（F ₀ -F）/F]为垂直坐标，log[Q]为水平坐标绘制直线，根据直线的斜率和截距计算n和Ka。在298、304和310 K下，α-淀粉酶的n值分别为1.182、1.16和0.992，α-葡萄糖苷酶的n值为1.466、1.325和0.998。n值接近1意味着SeSCP只有一个α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的结合位点。α-淀粉酶的K _a 值为34.313、25.256和10.486，α-葡萄糖苷酶的K _a 值分别为213.024、21.131和19.692；K _a 值随着温度的升高而降低，这表明SeSCP对酶的亲和力随着温度的增加而降低。ΔH和ΔS值由直线的斜率和截距获得，InK _a 为垂直坐标，1/T为水平坐标。接下来，我们计算了ΔG；ΔG<0表示反应是放热自发的，ΔH和ΔS<0表示反应主要由范德华力和氢键驱动。

表1 在298 K、304 K和310 K下，SeSCP与α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶相互作用的荧光淬灭常数和热力学参数

在另一项研究中，我们测试了几个与T2D相关的指标，结果见补充图1A-K。结果表明，SeSCP延迟了T2D的体重减轻，增加了饮水量，显著降低了小鼠的空腹血糖水平，改善了胰岛素抵抗，缓解了胰岛素释放不足的问题，并提高了血脂含量。

肠道α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的水平如图3A-B所示。我们的结果表明，T2D增加了肠道中的淀粉酶和葡萄糖苷酶水平。药物干预后，各组淀粉酶和葡萄糖苷酶水平均有不同程度的下降；具体而言，SCP在一定程度上降低了淀粉酶和葡萄糖苷酶水平，而SeSCP显著降低了淀粉酶水平，并将其恢复到正常饮食（NC）组记录的淀粉酶水平。SeSCP显著降低了葡萄糖苷酶水平，SeSCP组的水平甚至低于NC组的记录（p<0.05）。如图3C-D所示，模型（MC）组肠道SGLT1和GLUT2水平明显高于NC组，药物干预后，各组SGLT1、GLUT2的水平均显著降低（p<0.05）；在所有药物干预中，SeSCP在降低SGLT1和GLUT2蛋白水平方面效果最佳。

PCA的结果（图4（A））显示，MC组与NC组和SeSCP组明显分离。PLS-DA的结果如图4B-E所示。如图4B-C所示，MC组与NC组有显著差异（R ² Y=0.998，Q ² =0.844），MC组也与SeSCP组有显著不同（R ² Y=0.999，Q ² =0.713）。SeSCP-PC和SeSCP-SCP之间的差异如图4D-E所示；结果显示，SeSCP和PC组（R ² Y=0.993，Q ² =0.591）以及SeSCP和SCP组（R ² Y=0.987，Q ² =0.794）的粪便代谢物存在显著差异。

火山图如图5A-C所示。我们分别在SeSCP-MC、SeSCP-PC和SeSCP-SCP组中记录了164、115和242种代谢物，VIP值>1，组间差异显著（p<0.05）。然后，通过log2倍变化值过滤前20种差异代谢物，并将VIP值分别绘制为条形图和VIP值图；结果如图5D-I所示。通过比较柱状图和VIP值图，我们发现SeSCP-MC的共存代谢产物是腺嘌呤、甲基琥珀酸、3'-O-甲基鸟苷、LysoPA（0:0/18:2（9Z，12Z））、半胱氨酸-S-硫酸酯、半胱氨酸和地美环素（盐酸盐）。SeSCP-PC的共存差异代谢产物是酪氨酸、3-羟基-4-氨基吡啶、1-甲基腺苷、FOY 251、L-天冬酰胺、鸟苷、甲基琥珀酸和3-脲基丙酸。SeSCP SCP共存的差异代谢物是γ-谷氨酰谷氨酸、erythrodiol 3-decanoate、精氨酸琥珀酸、SM（d16:1/24:1（15Z））、SM（d18:1/24:1（15Z）），N-乙酰基-5-氨基水杨酸。我们使用小提琴图直观地描绘了上述差异代谢物，结果如图6A-C所示。

图5 SeSCP-MC（A）、SeSCP-PC（B）、SeSCP-SCP（C）的火山图；SeSCP-MC（D）、SeSCP-PC（E）、SeSCP-SCP（F）的柱状图；SeSCP-MC（G）、SeSCP-PC（H）和SeSCP-SCP（I）的VIP值图。

补充材料中提供了所有代谢途径和具有显著差异（p<0.05）的代谢物数据，并通过富集和拓扑分析对突出显著性的代谢途径进行了注释。在通路分析图中，较大的正方形表示影响因素更强，而较深的颜色表示富集更显著。通路分析图如图7A-D所示。通过比较NC-MC，我们发现标记了15条重要的代谢途径，其中氮代谢的影响最大，精氨酸生物合成的富集最为显著。通过比较SeSCP-MC，我们发现标记了19条重要的代谢途径，其中β-丙氨酸代谢的影响最大，嘧啶代谢的富集最为显著。通过比较SeSCP-PC，我们发现标记了12条重要的代谢途径，其中色氨酸代谢的影响最大，嘌呤代谢的富集最为显著。通过比较SeSCP-SCP，我们发现标记了25条重要的代谢途径，其中β-丙氨酸代谢的影响最大，精氨酸生物合成的富集最为显著。

SeSCP MC中显著不同代谢途径的整合，结果如图8所示。SeSCP主要调节氨基酸代谢途径，从而影响氨基酸含量、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢以及D-氨基酸代谢。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢是连接其他代谢途径的“桥梁”。我们发现更多的代谢物在嘧啶代谢和半胱氨酸和蛋氨酸代谢方面存在显著差异。

淀粉是一种常见的碳水化合物。α-淀粉酶可以将淀粉分解为由多个葡萄糖残基组成的低聚糖，然后被α-葡萄糖苷酶分解为葡萄糖。当葡萄糖进入血液时，它会增加血糖水平。淀粉分解代谢在体内正常发生；然而，淀粉分解代谢释放的大量葡萄糖增加了T2D患者的血糖水平。T2D患者的胰岛素抵抗和胰岛素释放水平不足会阻止血液中的葡萄糖为日常活动提供足够的能量，从而导致T2D患者出现高血糖。因此，了解α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用是必要的。在体外抑制活性实验中，SeSCP强烈抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶；此外，SeSCP比SCP更有效地降低了血糖水平。一些研究人员发现，硒修饰的多糖对这两种酶都有更高的亲和力，导致更强的抑制作用；然而，这是否适用于SeSCP需要进一步研究。体外实验结果表明，SeSCP可能缓解T2D。

然而，体外记录的降糖作用可能不会在体内发生。因此，为了验证SeSCP在体内具有相同的作用，我们在体内分析了其对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶水平的影响，结果表明SeSCP可以显著降低肠道中α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的含量。这证实SeSCP可以在体外和体内发挥降糖作用。葡萄糖通过SGLT1蛋白转运从肠道进入上皮细胞循环，并通过GLUT2蛋白转运从这些细胞进入循环。SeSCP显著降低了T2D小鼠肠道中SGLT1和GLUT2蛋白的水平。这两种蛋白质水平的降低防止了过量葡萄糖进入血液；通过肠道蠕动，葡萄糖进入大肠，在那里被细菌发酵产生有益的短链脂肪酸。

上述实验和T2D小鼠相关指标的检测表明，SeSCP可以改善T2D；然而，T2D是一种代谢性疾病，可导致各种并发症，如肾病、脑血管疾病和神经病变，严重损害T2D患者的健康。因此，仅仅提高血糖水平往往是不够的，因此，我们通过研究粪便代谢物来评估SeSCP的效果。

主成分分析（PCA）可以初步评估各组代谢物的变异性。PCA结果表明，T2D显著影响小鼠的粪便代谢物，而SeSCP对T2D小鼠的粪便代谢产物具有干预作用；OPLS-DA分析显示了类似的结果。通过比较SeSCP组与PC组以及SeSCP组和SCP组的OPLS-DA分析结果，我们发现SeSCP对T2D小鼠粪便代谢物的影响不同于二甲双胍和SCP的影响。我们进行了一项全面的研究来鉴定这些粪便代谢物。

我们筛选了T2D相关的差异代谢物。通过比较SeSCP MC，我们确定了六种代谢物，其log2倍变化值和VIP值存在显著差异。其中腺嘌呤、LysoPA（0:0/18:2（9Z，12Z））、半胱氨酸-S-硫酸酯和盐酸地美环素可能与T2D有关。在嘌呤代谢途径中，腺嘌呤与腺苷和黄嘌呤的产生有关，腺嘌呤水平的降低可能导致腺苷和黄嘌呤水平的降低。相关研究表明黄嘌呤与胰岛素抵抗或减少胰岛素分泌有关，黄嘌呤与T2D的风险呈正相关。

LysoPA（0:0/18:2（9Z，12Z））参与了许多代谢途径，其中与T2D更相关的代谢途径是甘油脂质代谢、甘油磷脂代谢、脂肪消化和吸收以及磷脂酶D信号通路。所有三种代谢途径都与脂肪代谢有关，表明SeSCP可以干预T2D诱导的脂肪代谢紊乱，磷脂酶D信号通路的促进导致PA（磷脂酸）的产生。PA可以作为PI3K/AKT信号通路的活性底物并促进该通路。半胱氨酸-S-硫酸盐的增加促进半胱氨酸和蛋氨酸代谢，产生L-半胱氨酸，具有抗炎、葡萄糖调节和胰岛素增敏作用。盐酸地美环素可以治疗与抗利尿激素分泌不当有关的问题，但需要进一步的研究来确定它是否可以改善T2D。通过比较SeSCP-PC，我们确定了8种代谢物，其log2倍变化值和VIP值存在显著差异，其中L-天冬酰胺和鸟苷可能与T2D有关。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢过程中L-天冬酰胺水平的增加会促进草酰乙酸的产生，草酰乙酸具有抗炎作用，并促进神经细胞对葡萄糖的利用。鸟苷与嘌呤代谢有关，鸟苷水平的增加可以减轻神经炎症和氧化应激。通过比较SeSCP SCP，我们确定了六种代谢物，其log2倍变化值和VIP值存在显著差异，其中N-乙酰-5-氨基水杨酸可能与T2D有关。N-乙酰-5-氨基水杨酸具有抗炎作用，在肠道中起着重要作用，因此可以改善T2D诱导的肠道炎症。通过比较SeSCP MC代谢产物，我们发现SeSCP改变了嘌呤代谢途径和脂质代谢途径，改善了胰岛素抵抗和脂质代谢紊乱。当将SeSCP与PC和SCP的代谢产物进行比较时，SeSCP显示出更强的抗炎作用，这可能是因为二甲双胍和SCP可以调节血糖水平，但抗炎作用不太显著。这些发现表明，SeSCP不仅具有降血糖作用，而且具有抗炎作用。

通过比较NC-MC，我们发现T2D干扰了几种代谢途径，包括赖氨酸降解、酪氨酸代谢、类固醇激素生物合成、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解以及柠檬酸盐循环（TCA循环）。其中赖氨酸和酪氨酸水平与T2D呈正相关；酪氨酸可能通过mTOR途径导致胰岛素抵抗。MC组显示出与类固醇激素生物合成相关的较高孕酮水平，这可能导致皮质醇水平升高，进而促进糖异生，从而增加血糖水平。支链氨基酸（BCAA）包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。支链氨基酸促进胰岛素释放，具有抗肥胖作用。然而，在肥胖个体中，与BCAA相关的代谢紊乱会导致β细胞线粒体功能障碍，从而加剧T2D。此外，T2D会干扰柠檬酸循环（TCA循环），这表明它也会影响能量代谢。

NC-MC和SeSCP-MC的途径分析图揭示了八条标记的共同代谢途径，包括精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢和初级胆汁酸代谢，这表明SeSCP对T2D有非常显著的影响。T2D下调精氨酸生物合成，精氨酸的缺乏导致NO合成不足。在精氨酸和脯氨酸代谢中，尽管蛋氨酸（Met）通过氧化还原反应保护细胞，但升高的Met水平可以预测T2D的风险。天冬氨酸代谢产物可以参与三羧酸循环（TCA循环），促进能量代谢。一项研究发现，谷氨酰胺可以恢复肥胖小鼠的胰岛素敏感性，改善血糖水平。氨基糖和核苷酸糖参与能量代谢。氨基糖可以转化为丙酮酸，参与三羧酸循环。核苷酸糖可以分解为五碳糖和含氮碱基，参与能量代谢。

在SeSCP-MC中，SeSCP干扰了与T2D相关的几种代谢途径，包括β-丙氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、醚脂质代谢、甘油磷脂代谢、甘油脂代谢、乙醛酸和二羧酸代谢以及泛酸和辅酶A生物合成。SeSCP上调β-丙氨酸代谢可增加骨骼肌对葡萄糖的摄取，从而改善T2D。SeSCP通过影响淀粉和蔗糖代谢来降低麦芽糖水平。由于淀粉酶催化淀粉转化为麦芽糖，SeSCP降低麦芽糖水平表明SeSCP对淀粉酶具有抑制作用。对醚脂质代谢和甘油磷脂代谢的调节表明，SeSCP在一定程度上干扰了T2D的脂质代谢紊乱。SeSCP通过影响乙醛酸和二羧酸的代谢来增加l-谷氨酰胺和l-丝氨酸水平，这两种氨基酸参与许多代谢途径并改善T2D。泛酸和辅酶A生物合成的下调与患糖尿病肾病（DKD）的风险有关，SeSCP上调泛酸和CoA生物合成表明SeSCP可以改善DKD和T2D。

通过分析SeSCP-PC的代谢途径，我们发现SeSCP上调了精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、β-丙氨酸代谢以及泛酸和辅酶A生物合成。然而，SeSCP被发现可以下调类固醇的生物合成。如前所述，SeSCP对这些代谢途径的调节被发现对T2D患者有益，这表明SeSCP改善这些代谢途径极其重要。我们的研究结果还表明，二甲双胍对2型糖尿病患者的粪便代谢影响相对较小，这可能是二甲双胍不能改善2型糖尿病并发症的原因。在色氨酸代谢中，PC下调色氨酸水平，这与T2D的风险呈正相关，表明PC影响了色氨酸的代谢。SeSCP上调嘌呤代谢中的l-谷氨酰胺，下调黄嘌呤；同样，SeSCP下调了类固醇激素生物合成中的孕酮。

通过比较SeSCP-SCP，我们发现SCP和硒对T2D有组合效应。我们发现了一些新的代谢途径。关于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，SeSCP上调了L-色氨酸和酪氨酸，这两种代谢产物水平与T2D呈正相关，表明SeSCP对这两种氨基酸代谢产物的影响相对较小。SeSCP在卟啉代谢中上调胆红素，一项研究发现胆红素改善了T2D患者的肾内质网应激和炎症反应。SeSCP在丙酮酸代谢中上调丙酮酸。在线粒体TCA循环中，TCA循环相关酶依赖丙酮酸进入线粒体，因此丙酮酸促进TCA循环，这也反映在柠檬酸盐循环（TCA循环）的代谢途径中。此外，生物体内糖酵解/糖异生中丙酮酸的上调也表明该生物体主要进行糖酵解，这在T2D中非常重要，因为T2D最明显的症状是患者无法利用葡萄糖，这反过来又会增加血糖水平。在这项研究中，给药SeSCP后发生糖酵解表明动物可以利用葡萄糖，SeSCP缓解了T2D。

SeSCP-MC中的许多代谢途径与l-丝氨酸有关，这表明SeSCP对T2D小鼠l-丝氨酸代谢有很强的干预作用。l-丝氨酸是通过糖酵解而不是糖异生合成的，因此，l-丝氨酸水平的增加表明SeSCP可以促进T2D小鼠的糖酵解，这对SeSCP对T2D的影响非常重要。l-丝氨酸水平的降低也会导致大脑中糖酵解的减少，这反过来会损害大脑，从而加剧T2D患者患AD的风险。此外，l-丝氨酸缺乏可导致T2D小鼠神经病变。总之，在这项研究中，SeSCP增加了T2D小鼠的糖酵解，降低了T2D患者AD和T2D诱导的神经病变的风险。硒和l-丝氨酸可以形成硒代半胱氨酸，用于合成各种硒蛋白，并通过mRNA编码发挥作用。尽管一些研究人员发现硒蛋白可以改善T2D，但SeSCP是否可以在这一过程中发挥作用仍有待研究。

在这项研究中，我们发现硒化SCP通过竞争性可逆抑制调节了α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶。SeSCP对T2D小鼠也有降血糖作用，这延迟了葡萄糖进入血液，从而调节了T2D小鼠的代谢，从而改善了T2D。SeSCP对T2D影响的主要代谢途径是β-丙氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、醚脂代谢、甘油磷脂代谢、乙醛酸和二羧酸代谢以及泛酸和辅酶A生物合成。SeSCP对T2D代谢的干预作用强于二甲双胍和SCP。它还调节了T2D肾病、T2D肾内质网应激和神经病变的标志物代谢产物。因此，本研究的结果表明，SeSCP可以有效降低T2D并发症的发生率，同时减轻T2D的影响。虽然SeSCP对T2D有很好的疗效，但能否应用于解决人类T2D还需要很长一段时间，未来SeSCP有望在治疗T2D的临床试验中进行，真正成为一种可以解决人类T2D的功能性食品。