科研 | 浙江大学：基于代谢组、转录组、微生物组和网药分析探讨糖尿病肾病潜在治疗药物石杉碱甲的作用机制研究（国人佳作）

原名： Huperzine A targets Apolipoprotein E: A potential therapeutic drug for diabetic nephropathy based on omics analysis

译名： 基于代谢组、转录组、微生物组和网药分析探讨糖尿病肾病潜在治疗药物石杉碱甲的作用机制研究

期刊： PHARMACOLOGICAL RESEARCH

IF： 9.1

发表时间： 2024.09

通讯作者： 胡丽丹

通讯作者单位： 浙江大学医学院附属儿童医院

使用考马斯亮蓝染色法测定了各组大鼠肾脏中的尿蛋白含量。给予Hup A后尿蛋白含量明显降低（图1A-B），同时肾脏指数在也显著下降（图1C）。DN组肾小球滤过率高导致大量蛋白尿可能与Scr水平低（图1D）有关。三组的BUN无明显差异(图1E)。对大鼠肾组织进行H&E和Masson染色，以评估Hup A治疗对DN大鼠组织学和形态学的影响(图1F)。H&E染色显示DN组肾小球基底膜增厚、系膜基质增加和肾小管空泡化。Masson染色显示，DN组的肾小球内出现纤维化病变，肾小管管腔和间质出现纤维化改变。此外从肾小球直径、肾小球硬化率和肾小管损伤评分来看，Hup A治疗显著减轻了肾小球和肾小管的损伤（图1G）。WB检测了维持正常肾小球滤过功能所必需的肾素和足素蛋白水平，如图1H所示，DN组的肾素和足素蛋白均明显下调（ P <0.05），Hup A治疗后可逆转了上述情况。

此外还通过CCK8检测法评估了Hup A在体外的细胞毒性作用，首先检测了不同浓度的Hup A对细胞活力的影响。结果表明，即使在200 μM的高浓度下，Hup A也不会明显影响细胞活力，这表明其具有极佳的安全性（图S1A）。此外观察还发现，用1 μM Hup A处理可降低炎症水平（图S1B），这与此前在大鼠模型中证明Hup A具有抗炎作用的研究结果一致。

为了评估Hup A在体内的潜在副作用，加入了第四个实验组（NC+Hup A，n=5），该实验组接受与NC组相同的治疗，但使用Hup A代替生理盐水（0.3mg/kg b.w.，每两天肌肉注射一次）。治疗一个月后与NC组相比，NC+Hup A组肝、肾功能参数和体重均无明显变化，血糖水平略有下降，但差异无统计学意义（ P >0.05）。结果与之前临床安全性数据相结合，进一步证实了Hup A的安全性。

图1 Hup A对DN大鼠肾脏的影响。(A)尿蛋白的考马斯亮蓝G250染色；(B)通过ELISA试剂盒检测大鼠uALB；(C)肾脏指数：肾脏重量/大鼠体重；(D)三组的Scr值。(E)BUN水平。(F)经 H&E和Masson染色 的代表性肾脏切片。蓝色箭头：肾小球基底膜增厚，黑色箭头：肾小球系膜基质增加。比例尺=50 μm；(G）对肾小球直径、肾小球硬化率和肾小管损伤评分进行量化，以观察肾小球肥大和肾损伤情况。(H）大鼠肾脏中肾素和足素的相对蛋白水平和定量分析（n=3）。* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，**** P < 0.0001。

为了深入研究Hup A治疗DN的分子机制，进行了转录组测序并分析了差异表达基因（DEGs）。如图2A与DN相比，在NC中发现了444个DEGs，其中255个下调，189个上调。与Hup A+DN组相比，DN组出现了81个DEGs，包括33个下调基因和48个上调基因（图2D）。与Hup A+DN组相比，NC组共鉴定出502个DEGs，包括283个下调基因和219个上调基因（图S2A）。在DN组中观察到Apoe和Apoc2大量上调，这种上调在Hup A处理后显著降低。

随后进行了GO分析，以确定DN和Hup A处理诱导的重要功能DEGs。如图2B所示，与DN相比NC通路主要富集了肾脏发育、肾脏系统发育、肾小球发育和脂质代谢过程（包括极低密度脂蛋白颗粒和富含甘油三酯的血浆脂蛋白颗粒）等过程。学习记忆和脂质代谢（脂肪酸代谢过程、低密度脂蛋白颗粒、高密度脂蛋白颗粒、血浆脂蛋白颗粒和脂蛋白颗粒）在DN与DN+Hup A中富集。KEGG通路富集分析结果如图2C所示，与DN组相比，NC组富集了糖尿病并发症的PPAR信号通路和AGE-RAGE信号通路。在NC与DN和DN与DN+Hup A的比较中，脂质代谢过程多次被富集，表明Hup A治疗对DN大鼠的脂质代谢有显著影响（图2E-F、S2B-C）。

采用非靶向代谢组分析的主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）分析（图S2D）来研究肾脏代谢的变化。NC组和DN组的样本表现出显著分散性，而DN+Hup A组的样本分布更接近NC组，这表明Hup A治疗可以恢复DN大鼠的新陈代谢。对NC组和DN组比较后发现，有36种代谢物受到不同程度的调节，其中34种代谢物上调，2种下调。鞘氨醇、16（R）-HETE和花生四烯酸（AA）在DN组明显上调，而在Hup A治疗后，鞘氨醇和16（R）-HETE显著下调，这表明这些物质可能参与了Hup A治疗DN的机制（图3A）。

我们通过对KEGG通路数据库进行分析，以确定相关的疾病通路、代谢通路和信号通路。图3B显示了前25个富集的疾病通路，包括慢性肾功能衰竭、慢性肾病和衰老相关代谢物，这意味着Hup A在DN中具有保护作用。图3C中展示了前20个富集的代谢通路和信号通路，主要包括AA代谢、细胞凋亡和PPAR信号通路。因此Hup A对DN的缓解作用可能与这些途径有关。

利用16S rRNA测序来评估Hup A治疗对肠道微生物群的影响。收集了多个时间点（第0天、50天和100天）的粪便样本，以研究肠道微生物群在DN进展过程中的动态变化。在图4A中，DN组的Shannon多样性指数降低，而DN+HupA组的Shannon多样性指数升高，表明Hup A治疗改善了微生物群的多样性。图4B显示，优势菌群（门水平）包括厚壁菌门、疣微菌门、放线菌门、拟杆菌门和脱硫杆菌门。如图4C所示，Hup A处理提高了DN降低的瘤胃球菌和大肠杆菌属丰度，同时降低了链球菌属、考拉杆菌属、肠球菌属、 Blautia 菌属和埃希氏菌属的丰度。

此外构建了一个优势物种网络，以阐明不同微生物（前50个OTUs）之间的相互作用，红线表示正相关，绿线表示负相关（图4D）。在NC组中乳酸杆菌的丰度极高。相比之下葡萄球菌和考拉杆菌的丰度较低。有趣的是葡萄球菌和考拉杆菌与乳酸杆菌呈负相关。在NC组中 Blautia 的含量也极低，但它与乳酸杆菌呈正相关。此外还将16S测序结果与KEGG和MetaCyc数据库相结合，进行了功能预测。图4E显示了KEGG预测的二级功能通路，其中氨基酸、碳水化合物和脂质代谢显著富集。图4F显示了MetaCyc预测的二级功能通路，其中氨基酸生物合成、脂肪酸和脂质生物合成以及糖酵解显著富集。这些结果表明，Hup A可通过调节肠道微生物群的组成以及涉及碳水化合物、脂类和氨基酸的关键代谢过程来发挥DN保护作用。

如图S2E随着时间的推移，NC组的Shannon指数呈上升趋势，而DN组和DN+Hup A组的Shannon指数呈下降趋势，但没有统计学差异。

为了阐明DEGs与代谢物之间的联系，对代谢组和转录组进行了Spearman相关性分析（图5A）。Hup A处理后显著下调的关键基因（Apoe和Apoc2）与脂质代谢生物标志物（鞘氨醇、16(R)-HETE和AA）之间的相关性。结果表明Apoc2与16(R)-HETE呈显著正相关，而Apoe、Apoc2和AA与鞘氨醇无显著相关。

对代谢组和微生物群进行Spearman相关性分析，以确定代谢物与微生物群组成（属水平）之间的关系。如图5B所示，AA与葡萄球菌呈显著正相关。鞘氨醇和16(R)-HETE与肠球菌呈显著正相关，与链球菌、考拉杆菌、布氏杆菌和埃希氏菌属呈正相关，与瘤胃球菌属和考氏杆菌属呈负相关。此外还建立了定向检测鞘氨醇的质谱方法。结果表明鞘氨醇在DN中增加，经Hup A处理后恢复到对照组水平。