抗体药物偶联物开发新进展

摘要：抗体药物偶联物（ADCs）是由抗体、连接子和小分子有效载荷组成的癌症治疗剂。ADCs利用抗体的特异性将有毒有效载荷靶向肿瘤细胞。静脉给药后，ADCs进入循环系统，分布到肿瘤组织并结合到肿瘤表面抗原。然后，抗原经历内吞作用将ADC内化到肿瘤细胞中，在那里它被运输到溶酶体中释放有效载荷。释放的有毒有效载荷可以通过DNA损伤或微管抑制诱导凋亡，并通过旁观者效应杀死周围的癌细胞。第一个ADC药物于2000年获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，但在接下来的十年中没有新的ADC药物获得批准。从2011年到2018年，有四种ADC药物获得批准，而在2019年和2020年又有五种ADC进入市场。这表明ADC的临床开发呈上升趋势。本综述总结了最近的临床研究，特别关注ADCs体内处理如何影响其设计。我们旨在提供关于当前ADCs的全面信息，以促进未来的发展。

1.引言

早在20世纪中叶，医生和科学家们就开始使用细胞毒性化学物质来治疗晚期癌症患者。最早的试验之一是将氮芥应用于治疗非霍奇金淋巴瘤患者。经过氮芥治疗后，肿瘤出现了退缩。尽管退缩是短暂和不完全的，但在当时鼓励了该领域的研究人员。在接下来的几十年里，烷化剂（例如环磷酰胺和顺铂）和抗代谢物（例如甲氨蝶呤和氟尿嘧啶）被开发并用作癌症治疗。在20世纪后期，单克隆抗体（mAbs）的出现使得开发更具针对性的抗癌药物成为可能。同时，越来越多的肿瘤标志物和肿瘤表面抗原被发现和鉴定，为抗体治疗提供了靶点。当它们结合形成抗体药物偶联物（ADCs）时，有毒化合物（有效载荷）提供了杀死肿瘤细胞的效果，而抗体提供了靶向分布。

经过几十年的时间和努力，第一种ADC药物Mylotarg在2000年被美国食品药品监督管理局（FDA）批准。它用于治疗复发性CD33阳性急性髓系白血病患者。尽管Mylotarg由于毒性问题在美国一度被退市，但它是ADC药物开发的里程碑，并为基于ADC的癌症治疗树立了先例。在接下来的十年里，没有新的ADCs获得临床批准。2011年之后，几种新的ADC药物相继推出。2011年，针对CD30的Adcetris被批准用于治疗霍奇金淋巴瘤。2013年，针对人表皮生长因子受体2（HER2）的ado-trastuzumab emtansine（T-DM1）被批准用于治疗HER2阳性乳腺癌。2017年和2018年，分别针对CD22的Besponsa和Lumoxiti被批准用于治疗急性淋巴细胞性白血病。到2019年，ADC开发呈上升趋势，一年内批准了三种ADC药物。Polivy、Padcev和Enhertu分别被FDA批准用于治疗B细胞淋巴瘤、尿路上皮肿瘤和HER2阳性乳腺癌。在过去的一年里，另外两种新的ADC药物获得了批准，Trodelvy用于三阴性乳腺癌，Blenrep用于复发和难治性多发性骨髓瘤（如表1和图1所示）。

与此同时，制药公司在克服与ADCs相关的技术障碍方面做出了巨大努力，包括血浆稳定性、有效载荷解离、低血液保留时间、最小肿瘤穿透、降低有效载荷效率、免疫原性、非靶向毒性和药物抗性。在2010年至2019年的十年间，发表了超过60,000篇关于ADCs的研究论文，而只有少数药物进入市场。在新推出的ADC药物背后，有大量因安全或有效性问题而终止的ADC临床研究。更好地理解ADCs及其小分子有效载荷将提高临床成功的可能性。因此，本综述根据其预期的体内处理途径检查ADC药物的机制。它总结了近年来针对不同靶向肿瘤类型的几项ADC临床研究，以期为ADCs的临床前开发提供框架。

2.ADCs的结构 

ADC是通过将小分子药物（有效载荷）与单克隆抗体通过连接子共价偶联而形成的复合物。这三个部分共同定义了ADC药物的整体物理和化学性质、功效和可能的问题。典型的ADC设计如图2所示。

2.1.抗体

抗体（Abs）是由浆细胞产生的糖蛋白，可以特异性地结合相应的抗原，通常由可变抗原结合域（Fab）和与免疫细胞受体结合的恒定域（Fc）组成。免疫球蛋白（Ig）一词更一般地指代Abs和所有与抗体结构相似的球蛋白（Cushley & Owen, 1983）。抗体可以分为五类：IgG、IgA、IgD、IgE和IgM。在五种类型中，IgM是五聚体，尽管它具有高亲和力，但其分子量过大，穿透性差。IgA具有二聚体结构和大分子量。IgD对蛋白酶敏感，容易降解，因此其半衰期短。IgE非常罕见，只占人体血清中总免疫球蛋白的0.002%。然而，IgG可以占人体血清中总免疫球蛋白的75%~85%，分子量约为150千道尔顿（kDa）。由于其适中的分子量、高亲和力、长半衰期、强穿透性和易于制备，IgG已成为选择ADC抗体的首选。IgG有四种亚型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgG1易于制备，具有可被细胞内降解的铰链结构，因此大多数ADCs都是以IgG1骨架构建的。IgG2和IgG4的Fc部分活性弱，因此它们引发抗体依赖性细胞毒性和补体依赖性细胞毒性的能力弱，因此基于IgG2和IgG4的ADCs可以减少由Fc片段引起的非靶向组织聚集的副作用。一些缺乏Fc功能的ADCs已被FDA批准（例如Mylotarg和Besponsa）。细胞毒性药物通常连接到Fc或恒定区域，而不是Fab区域，以避免对抗原检测和结合产生负面影响（如图2所示）。

作为ADC肿瘤分布的导航系统，ADC中使用的抗体需要具有弱免疫原性、高靶向特异性、高结合亲和力、长半衰期和在血液循环中的良好稳定性。抗体和ADCs的免疫原性是其循环半衰期的一个决定因素。早期的抗体治疗和ADC研究使用小鼠mAbs，可能会引起强烈的急性免疫反应，而现在大多数ADCs使用部分人源化或完全人源化的抗体。高特异性有助于将细胞毒素集中在肿瘤部位，以实现靶向药理效果。特异性低的ADC更可能对正常组织造成毒性。ADC抗体应具有高结合亲和力，大多数ADCs的结合亲和力在0.1到1.0纳摩尔范围内，也称为平衡解离常数或Kd值，但很少有发表的数据解决了ADCs的最佳结合亲和力。关于结合亲和力的一个理论（结合位点屏障理论）解释说，抗体亲和力越高，抗原密度越高，越多的抗体结合在实体肿瘤表面而不是渗透到肿瘤组织内部。最近的一项研究准备了三种具有不同靶向结合亲和力的ADCs，发现这三种ADCs在体外细胞毒性几乎相同。这三种ADCs对小型BxPC3肿瘤具有等效的抗肿瘤效果。然而，对于大型BxPC3肿瘤，高亲和力ADC显示出比低亲和力ADC更强的抗肿瘤活性。此外，免疫荧光染色表明，高亲和力ADC分布在整个肿瘤中，而低亲和力ADC主要定位在肿瘤血管附近，表明分布和抗肿瘤活性可能取决于结合亲和力。Kang等人准备了一个针对HER2的“酸开关”ADC。它在接近中性pH（在血浆和细胞外微环境中）时具有更高的亲和力，但在酸性pH（在内体或溶酶体中）时亲和力较低，这允许更多的细胞有效载荷释放。该抗体与细胞外相比，在细胞内的亲和力弱了250倍。在异种移植肿瘤模型中，与T-MD1相比，工程化ADC显示出增加的溶酶体传递和更高的治疗效果。此外，对于相同的肿瘤表面抗原，ADCs的抗体结合到不同的表位具有不同的内化率。快速内化可以提高ADCs的效率。与小分子相比，抗体从血浆进入组织。在ADCs中使用抗体作为靶向机制，对于细胞毒素的局部传递显示出显著的益处。

2.2.有效载荷

有效载荷，也称为“细胞毒素分子”或“弹头”，是影响ADCs性质和活性的重要因素。细胞毒素分子的机制决定了ADCs的疗效和不良反应。目前，常用的细胞毒素分子几乎都是基于天然产物的，包括微管抑制剂（如auristatin、maytansinoids）、DNA损伤剂（如calicheamicin、duocarmycins、anthracyclines、pyrrolobenzodiazepine二聚体）和DNA转录抑制剂（amatoxin和喹啉生物碱（SN-38））。在十种获批的ADC药物中，使用了六种不同的小分子有效载荷（如表1、图1和图3所示）。三种ADCs提供单甲基auristatin E（MMAE），两种药物提供calicheamicin，单甲基auristatin F（MMAF）、mertansine（DM1）、SN-38和DXd也成功应用。适合作为ADCs有效载荷的毒素或毒素骨架必须具有以下段落描述的复杂特性。

2.2.1.超高毒性

有效载荷的内在效力必须非常高，因为由于mAbs进入肿瘤组织的低渗透性、肿瘤细胞抗原表达有限、细胞内吞作用低和ADCs在血液循环中的代谢分解，有效载荷在目标细胞中的积累是有限的。当前的有效载荷可以在亚纳摩尔浓度下杀死肿瘤细胞。ADC有效载荷通常作用于参与基本细胞生存过程的少数细胞靶标，这确保了在遗传异质性肿瘤组织中的高细胞毒性，并防止癌细胞通过药物抗性机制逃逸。

2.2.2.细胞内有毒靶标

典型ADC有效载荷的靶标位于细胞内，大多数ADCs需要进入肿瘤细胞以释放其有效载荷。许多来自植物、动物和微生物的高度有毒制剂是膜靶向的，阻断神经元上的离子通道或引起凝血障碍。这样的毒素不适合用作ADC有效载荷。目前，ADCs的细胞内靶标集中在核酸或微管蛋白上。

2.2.3.有效载荷特性

有效载荷的分子量应该相对较小，以减少免疫原反应的风险。此外，有效载荷应具有适当的水基缓冲液溶解度，以便于与抗体偶联。有效载荷的结构中应包含一个适合通过连接子与抗体偶联的功能团。有效载荷还应在溶酶体的低pH环境中保持稳定。当使用不可切割的连接子时，毒素在降解为连接子残留物-有效载荷形式时应保持其细胞毒性，例如在肿瘤细胞中断裂二硫键后的硫醇衍生物形式。

2.3.连接子

ADCs的第三个重要组成部分是连接子，它充当抗体和有效载荷之间的连接。连接子需要在血液中保持稳定，以保持细胞毒素有效载荷附着在抗体上，但一旦ADC进入肿瘤细胞或被运输到溶酶体，连接子应迅速分解以释放有效载荷。连接子影响ADCs的许多重要特性，如药物-抗体比率或DAR值（一个抗体上附着的有效载荷数量）、有效载荷释放时间、治疗指数（TI）和药代动力学/药效学。连接子在血液中的稳定性非常重要。稳定性有限的连接子容易发生非特异性切割，导致更广泛的药物释放和非靶向毒性。最初ADCs使用的连接子稳定性有限，随后快速释放有效载荷导致了较差的治疗指数和类似于非偶联化疗的副作用。在应用新的连接子后，这种情况有所改善。常用的连接子包括缬氨酸-瓜氨酸（VC）连接子、N-琥珀酰亚胺4-（2-吡啶基二硫）丁酸酯（SPDB）连接子、腙连接子、琥珀酰亚胺4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸酯（SMCC）连接子、马来酰亚胺己酰（MC）连接子、N-琥珀酰亚胺-4-（2-吡啶基二硫）戊酸酯（SPP）连接子、硫醚连接子、四肽连接子和碳酸酯连接子（表1、图2和图4）。

2.3.1.药物-抗体比率（DAR）

药物-抗体比率（DAR）描述了与抗体共轭的药物分子的平均数量。通常，链间二硫键和表面暴露的赖氨酸和半胱氨酸残基是抗体上最常用的连接子修饰位点。糖基化基团上的羟基和其他残基很少用作偶联位点。大多数临床ADC采用非均质偶联技术，并严格控制平均修饰，以实现2到8范围内的DAR值，这通常导致具有不同DAR值的ADC混合物。目前，许多位点特异性连接子方法（同源偶联技术）正在研究中，以控制DAR值并准备更稳定、低聚集的ADC。

根据连接子在肿瘤细胞内的切割特性，连接子可以分为两种类型：可切割和不可切割（稳定）。具有可切割连接子的ADC可以通过连接子切割在肿瘤细胞内快速释放有效载荷，而具有稳定连接子的ADC只有在进入肿瘤细胞的溶酶体并被蛋白酶完全降解后才能释放有效载荷。可切割连接子在循环中的代谢更高，可能导致非靶向毒性。两种连接子类型产生的代谢物也不同。具有可切割连接子的ADC可以释放完整的细胞毒素分子，而具有稳定连接子的ADC释放与氨基酸连接的有效载荷。通常，具有稳定连接子的ADC比具有可切割连接子的ADC具有更长的半衰期和更低的清除率。此外，具有可切割连接子的ADC即使在内化过程不顺利的情况下也能释放其有效载荷。

2.3.2.可切割连接子

可切割连接子可以通过多种机制切割，包括酸敏感键的水解、酰胺键或酯键的酶促切割，或二硫键的还原切割。这些机制可能在肿瘤细胞的初级和晚期内体中起作用，并且对溶酶体没有严格要求。可切割连接子对细胞内环境敏感。例如，酸敏感连接子在血液中通常稳定，但在低pH溶酶体环境中迅速切割。二硫键连接子通过细胞内谷胱甘肽（GSH）还原反应释放有效载荷。如果释放的有效载荷能够穿过肿瘤细胞膜，它们可以杀死附近的癌细胞——这被称为旁观者效应。例如，可切割ADC DS-8201a释放其膜通透性有效载荷DXd，杀死靶向癌细胞周围的HER2阳性细胞，但不杀伤更远的细胞。这对治疗HER2异质性肿瘤是有益的。然而，可切割连接子并不总是能够实现旁观者效应，而是取决于释放的有效载荷的膜穿透性和电荷特性。旁观者效应有利于应对异质性肿瘤和更深入地渗透到实体肿瘤中，这些肿瘤对偶联物的可及性较低。同时，也有缺点，如杀死目标肿瘤细胞附近的正常细胞或免疫细胞。

2.3.3.不可切割连接子

不可切割连接子由具有抗酶特性的结构组成，并且在血液中稳定。代表不可切割连接子的是硫醚和MC连接子。它们的有效载荷只有在ADC被运输到溶酶体并分解成氨基酸后才能释放。稳定连接子的优点包括细胞外最小限度的有效载荷释放，从而减少非靶向毒性并提高治疗指数，但缺点包括释放效率低和需要良好的内化过程。此外，稳定连接子不实现旁观者效应，因为代谢后的有效载荷形式（赖氨酸或半胱氨酸残基-连接子-有效载荷形式）具有电荷，限制了其扩散。

3.激活ADC的机制和体内处理 

3.1.第一步 - ADC通过静脉注射进入血液并分布到组织 

3.1.1.ADC在组织中的分布 

ADC通常通过静脉（IV）注射给药，以确保快速全身分布并避免降解。注射后，ADC最初分布到血流丰富的器官（如图5，步骤1所示）。一些器官和组织的屏障系统，如血-睾屏障和血-脑屏障，减少了ADC的组织进入。随着时间的推移，ADC逐渐进入器官和组织的间质空间，这降低了血液浓度并增加了分布体积。在此过程中，ADC到达肿瘤表位，抗体部分与目标抗原结合。

ADC的分布特性主要由抗体决定，抗体占整个ADC分子量的95%以上。ADC显示出与抗体相似的药代动力学（PK）特性，如低清除率、长半衰期、小分布体积、口服生物利用度差、非线性分布和消除，以及免疫原性。IgG的分子量约为150 kDa，其半径约为15 nm。IgG等抗体的半衰期可以达到21天，这得益于新生儿Fc受体（FcRn）介导的IgG循环。IgG的Fc段可以特异性地结合主要组织相容性复合体家族的FcRn，形成IgG-FcRn复合物，该复合物可以在内体的酸性条件下高亲和力地被内化为细胞。然后IgG-FcRn复合物可以循环回细胞膜表面并暴露于低碱性pH，这降低了复合物的亲和力并释放抗体进入循环。通过这种方式，IgG的半衰期显著延长。此外，当ADC作为一种生物大分子进入人体时，它可能会刺激体液免疫并引起抗ADC免疫反应，从而加速ADC的失活或消除，防止其组织分布。

ADC在循环中的动力学也受到有效载荷和连接子的影响，改变了抗体的电荷分布和亲水性，从而改变了抗体在循环中的聚集和沉降特性。由于DAR和有效载荷分布的异质性，ADC显示出结构多样性，导致异质性解离，这与简单的抗体药物不同。ADC的实际DAR值通常在0到8之间波动（平均值通常为3到5），使PK研究更加困难。

3.1.2.ADC在组织分布的评估

由于ADC由抗体、连接子和有效载荷组成，因此需要将这三个部分作为一个整体来研究吸收和分布。同时，由于ADC可能在体内降解，单独分析这三个部分的分布和代谢也很重要，这可以用来检查ADC在到达目标之前可能降解的后果。

放射性同位素标记是研究ADC分布的常用方法。放射性同位素，如3H、131I和89Zr，可以同时或分别用于标记抗体和小分子药物。静脉给药后，可以实时监测整个ADC或释放后的单个抗体和有效载荷的分布。在血液或肿瘤组织中，可以用不同放射性同位素标记的抗体和药物分子进行计数，以确定ADC的分布和切割情况。同时，可以将标记同位素的ADC与标记同位素的抗体进行比较，研究由于添加有效载荷而引起的分布差异。血液样本的液体闪烁计数可以用来分析给药后的药物分布参数。近年来，全身定量自显影技术也被应用于研究ADC的分布。

在与肿瘤表面抗原结合之前，连接子切割和ADC代谢可能在循环中发生。这是ADC开发和临床研究中的一个焦点。DAR变化影响ADC的分解，因为它决定了药物载荷，并反映ADC的安全性和有效性。对于血液循环中的ADC，DAR分析主要检查随给药时间变化的ADC中总药物分子与抗体分子比例的摩尔浓度变化。主要的分析方法是液相色谱-质谱联用（LC-MS），它具有高灵敏度、分辨率和准确性。此外，具有不同DAR值的ADC分子的绝对分子量不同，因此可以通过电喷雾电离或基质辅助激光解吸质谱分析DAR。在质谱上，具有不同DAR值的ADC可以通过单独的质荷比峰进行识别，然后根据峰面积的计算获得相对含量（即DAR的分布）。最新的高分辨率质谱仪，如飞行时间和轨道离子阱（orbitrap），结合智能软件的去卷积计算，使ADC的质谱分析更加方便和准确。

3.1.3.ADC组织分布的问题和改进策略

ADC的生物分布使其具有治疗效果。早期对放射性标记抗体的临床剂量测定研究表明，无论肿瘤类型或抗体靶标如何，只有约0.1%的抗体剂量在输注后24小时定位于实体肿瘤质量中。乐观的是，包括ADC在内的高分子量药物可以从肿瘤血管和肝脏、骨髓或淋巴器官的窦状血管中渗出，但不能从其他正常血管中渗出，这被称为增强的渗透和保留（EPR）效应。EPR效应或增强的血管通透性可以维持快速肿瘤生长所需的足够营养和氧气供应，这也有利于60 kDa以上的内源性和外源性蛋白质的积累，有利于基于大分子的实体肿瘤治疗。然而，据报道，肿瘤组织外的ADCs受到增加的流体静压和肿瘤淋巴通道和血管阻塞的阻碍。与直接与血液肿瘤结合不同，ADCs结合实体肿瘤需要经过四个步骤：到达肿瘤血管、渗出血管、分布到肿瘤组织和与肿瘤靶标结合。最佳的药物治疗效果取决于有限的细胞毒素分子、肿瘤对ADC的摄取、肿瘤血管密度、膜通透性等速率限制步骤。此外，ADC与FcRn之间的亲和力、ADC的电荷和物理化学性质以及靶标的内化会影响ADC的分布。在循环中，早期有效载荷释放或ADC与正常组织结合引起的毒性和/或副作用是不能忽视的问题。非靶组织和器官可以捕获ADCs，特别是在血流量大和吞噬功能强的组织（如肠道和肝脏）。例如，肝细胞吞噬了许多ADC分子，它们丰富的代谢酶分解这些ADCs，释放的有效载荷然后经历第一和第二阶段代谢，导致药物失活。在表达靶标的正常细胞中的ADC分散也可能导致副作用或治疗失败。例如，用表皮生长因子受体（EGFR）靶向ADC（depatuxizumab mafodotin）治疗复发性胶质母细胞瘤引起的副作用包括角膜异常。当用于治疗HER2阳性乳腺癌的HER2靶向ADC（trastuzumab emtansine（T-DM1））时，观察到结节性再生性增生和角膜异常的副作用。叶酸受体α靶向ADC（mirvetuximab soravtansine）在治疗耐铂卵巢癌患者后也显示出角膜异常。用CD79b靶向ADC（polatuzumab vedotin）治疗非霍奇金淋巴瘤患者导致70%的患者出现周围神经病变。

此外，基于Fc结构域的非靶向毒性也有报道。一个缺乏末端半乳糖的ADC抗体通过甘露糖受体介导的内吞作用。甘露糖受体是一种凝集素，可以特异性地结合并内化具有特定无半乳糖Fc段的抗体，这在肝脏和脾脏窦状内皮细胞和免疫细胞表面发现。

3.2.第二步 - ADC与肿瘤细胞表面的靶标抗原结合

3.2.1.ADC与肿瘤表面抗原的相互作用

在血液循环足够时间后，ADC可以遍布全身并到达肿瘤组织。到达肿瘤组织的ADC可以使用抗体的抗原结合位点与肿瘤细胞表面的靶标抗原结合（如图5，步骤2所示）。然后，靶标抗原-ADC复合物可以经历受体介导的内吞作用，将ADC转移到肿瘤细胞内进行后续的运输和处理。通常，靶标肿瘤细胞应在细胞表面有适度的抗原表达水平（10⁵/细胞）。

肿瘤靶标蛋白的选择是ADC设计的一个很好的起点。它决定了ADC将针对的肿瘤类型，并可以预测在临床试验中可能遇到的问题。近年来，在ADCs的开发过程中评估了许多靶标。这些靶标大多是肿瘤表面抗原。肿瘤表面抗原可以分为两类：肿瘤相关抗原（TAA）和肿瘤特异性抗原（TSA）。其中，TAAs是肿瘤细胞中高表达但在正常细胞中低表达的蛋白质。TAAs通常是生长因子受体、癌胚抗原或白细胞分化抗原，可以用于肿瘤的临床诊断和分类。例如，HER2是细胞膜上表达的生长因子受体，在乳腺癌、胃癌和其他癌细胞中高度表达。目前，针对HER2的ADCs有Fam-trastuzumab deruxtecan（Enhertu）和Ado trastuzumab emtansine（Kadcyla）。或者，CD30是一种白细胞分化抗原，在各种类型的霍奇金淋巴瘤细胞表面广泛过表达。Brentuximab vedotin（Adcetris）针对CD30并用于治疗淋巴瘤。

TSA仅存在于肿瘤细胞表面，而不存在于正常细胞，因此它们可以用作区分肿瘤组织和正常细胞的标记。TSA是独特的抗原，由突变产生。辐射、化学致癌物和病毒等物理因素的外部环境也可以诱导TSA的产生。当表达TSA的细胞死亡或表达TSA的肿瘤组织发生坏死时，TSA会释放到血液中，可以被检测和识别。TSA有潜力被用作抗体靶标，以开发相应的ADC药物。目前，大多数临床试验中的ADC靶标是TAAs，但许多针对TSA的ADC正在进行临床或临床前研究。因此，针对TSA的ADC未来可能会被批准，有潜力减少ADC引起的非靶向副作用。

3.2.2.肿瘤标志物检测研究

对于ADC药物的临床使用，患者分层非常重要。一些癌症患者可以表达与ADC靶标相对应的肿瘤抗原，而有些患者则没有。对于后一组患者，需要其他治疗方案。例如，Trastuzumab-DM1被批准用于治疗乳腺癌患者。靶标是HER2，但约75%的乳腺癌患者HER2阴性。在患者中检测肿瘤标志物尤为重要。肿瘤标志物是肿瘤细胞产生的物质，与肿瘤的形成和发生有关。这些物质最初存在于肿瘤细胞的核、胞质、膜或细胞液中。随着肿瘤的发展，标志物的表达增加。

放射免疫分析和酶联免疫吸附测定（ELISA）是肿瘤标志物的传统识别方法。目前，自动免疫化学分析仪器是常用的检测器，可以快速准确地测量血清肿瘤标志物。检测机制基于抗原-抗体相互作用。通常，荧光素酶标记的抗体特异性结合肿瘤标志物，并在加入发光剂后发光。在检测化学反应时，一些化学基团被氧化形成激发态，并在返回基态时发射一定波长的光子。这是一种将化学反应与免疫反应相结合的高灵敏度分析方法，也称为光电倍增技术。自动化仪器使实验过程非常简单；获得的血液样本可以直接加入化学发光免疫分析系统进行检测，然后输出分析结果。

上述检测方法是血清学检测方法，通常用于初步识别。在肿瘤组织中检测肿瘤标志物对于ADC治疗选择更为重要。肿瘤组织中肿瘤标志物的组织学检测可以显示肿瘤组织中肿瘤标志物的数量、分布和均匀性。此外，研究肿瘤抗原调节因子，如肿瘤标志物更新率和异质性，是考虑的重要因素。

3.2.3.ADC靶标选择的问题和策略

3.2.3.1.特异性和表达水平。靶标的特异性和表达水平是ADC设计中靶标选择的核心。高特异性意味着一种抗原在肿瘤细胞上高度表达，而在正常细胞上相应低表达或不存在。高表达水平意味着与正常细胞或其他肿瘤细胞类型上相同抗原的表达水平相比，这种抗原在肿瘤细胞表面或肿瘤组织上的数量要多得多。抗原的高特异性和高表达水平可以增加ADC在肿瘤组织的招募并减少向正常组织的传递。大多数选择的靶标是那些在肿瘤及其转移中具有高特异性和高表达水平的靶标。尽管不常见，如果选择在正常组织中也表达的肿瘤抗原作为靶标，正常组织中的表达应限于一个小区域，或者正常组织应具有再生能力，以最小化ADC对健康组织的毒性。

3.2.3.2.内化。大多数当前的有效载荷具有细胞内靶标，因此内化对细胞毒性活性特别重要。由于内化由靶标抗原的性质决定，因此在ADC准备之前应了解目标内化。此外，细胞表面抗原的成功循环或补充也至关重要。可以快速补充的细胞表面抗原可以积累更多的ADC进入细胞，从而提高有效载荷传递和肿瘤细胞死亡的可能性。然而，快速补充的抗原也可以从肿瘤组织表面耗尽ADC，并阻止内部肿瘤穿透。

3.2.3.3.异质性。可以在肿瘤细胞之间或患者之间发现靶标的异质性。关于乳腺癌，HER2阳性乳腺癌患者可以从针对HER2的ADC中受益，但其余患者则不会从中受益。肿瘤细胞内的异质性意味着例如在给定的HER2阳性乳腺癌患者中，并非所有肿瘤细胞都表达HER2。目标阴性细胞的比例越大，ADCs的治疗效果越弱。因此，对于肿瘤异质性，用两个或更多ADC进行组合治疗可能是有效的，值得研究。

3.2.3.4.肿瘤基质作为靶标。目前，大多数ADC旨在针对肿瘤表面抗原，这取决于内吞作用。然而，针对肿瘤基质（不依赖内吞作用）的ADC越来越受到关注。不同癌症类型的癌症相关微环境可以共享许多共同特征，因此这种方法最终可能会将ADC治疗的应用扩展到严格的抗原阳性患者选择之外。此外，大多数实体瘤具有丰富的基质，阻碍了高分子剂的分布，作为防止ADC攻击癌细胞的屏障。针对基质的ADC可以通过结合肿瘤基质细胞后的机制（如细胞外纤溶酶或其他蛋白水解切割）释放有效载荷。释放的小分子有效载荷可以轻易进入并杀死穿越基质障碍的癌细胞。

3.3.第三步 - ADC通过受体介导的内吞作用进入肿瘤细胞

3.3.1.ADC的内吞途径

在血液中循环后，ADCs到达肿瘤组织，并与肿瘤细胞表面的靶标抗原结合。形成抗原-抗体复合物后，该复合物将经历受体介导的内吞作用，将ADC运输到溶酶体以释放有效载荷（如图5，步骤3所示）。根据作用机制，ADCs的内吞作用可以分为四种类型：通过网格蛋白介导的内吞作用、细胞膜洞穴状内陷即洞穴蛋白介导的内吞作用、巨胞饮作用，以及不依赖网格蛋白和洞穴蛋白的内吞作用。通常，ADCs通过网格蛋白介导的内吞途径进入细胞。

3.3.1.1.网格蛋白介导的内吞作用。网格蛋白介导的内吞途径是生物大分子内化最重要的受体依赖性内吞途径。网格蛋白途径存在于哺乳动物细胞中，以摄取营养物质、调节细胞表面受体水平，并传递细胞间信号。网格蛋白介导的内吞作用有四个步骤：网格蛋白涂层的组装、膜内陷和涂层坑成熟、坑的收缩和小泡的分裂，以及小泡的去涂层。网格蛋白（190 kDa）可以涂层抗原-ADC复合物，形成直径100-150 nm的小泡。复合物形成后，网格蛋白和适配蛋白2将被招募到细胞膜上，包裹抗原-ADC复合物然后内陷进入细胞形成网格蛋白胶囊小泡。动力蛋白，一种GTPase，将被招募到细胞膜和小泡之间的连接处，并形成一个环，将小泡从细胞膜上分离，允许小泡进入肿瘤细胞。随后，小泡将转变为pH值为5.9至6.0的早期内体。早期内体可以要么将抗原-ADC复合物运回细胞表面，要么转变为晚期内体并将复合物运输到溶酶体。晚期内体（也称为多泡体）在早期内体中逐渐形成，pH值较低。然后晚期内体与溶酶体融合以释放ADC。从内吞作用到降解，这个过程需要几个小时，在此期间有效载荷在肿瘤细胞中积累。

3.3.1.2.洞穴蛋白介导的内吞作用。像网格蛋白介导的内吞作用一样，洞穴蛋白介导的内吞作用通常是受体依赖性的。洞穴是由胆固醇和聚合的洞穴蛋白（21 kDa）形成的脂筏结构（直径55-80 nm）。洞穴可以介导洞穴状内陷，包裹抗原-ADC复合物进行内化，其内容物和体积小于网格蛋白介导的内吞作用。洞穴是动态的内吞载体。洞穴芽和在一秒钟内重新融合到质膜上。这是洞穴从质膜上芽出，其中一些与质膜融合，呈现出明显的徒劳循环，而其他则转变为早期内体然后返回到质膜。研究表明，洞穴蛋白-1促进了T-DM1的内化并增强了药物敏感性。此外，一项研究表明，洞穴蛋白介导的内吞作用是一种新的T-DM1抗性机制，内化T-DM1然后将其从细胞中排出。

3.3.1.3.巨胞饮作用。巨胞饮作用是一种自发的内吞途径。它也可以通过生长因子、趋化因子或Toll样受体的参与来诱导。这种途径像吞噬作用一样，是肌动蛋白介导的。此外，微管和微丝在膜片状突起和巨胞饮小泡闭合中起着重要作用。在延伸一定长度后，质膜形成大约50-100个微绒毛状结构（约0.5 μm至5 μm），可以包裹ADC。这个小泡被称为巨胞饮小泡。巨胞饮作用在细胞中的存在时间很短（约5-20分钟）。这个过程将包裹的内容物运输到溶酶体。对于正常组织，巨胞饮作用可以清除凋亡细胞，参与免疫反应，介导某些病原体的入侵和更新细胞膜。巨胞饮作用为非选择性内吞作用细胞外营养物质和液体大分子提供了有效途径。在肿瘤细胞中，如v-Src或K-Ras等突变基因可以增强巨胞饮作用。由于缺乏营养供应，肿瘤组织中心有大量死细胞（70-80%）。周围的活肿瘤细胞可以通过巨胞饮作用从死细胞中吸收生物大分子和营养物质，大大提高了细胞资源的利用率。

3.3.2.研究ADCs细胞内运输和定位的方法

对于ADC内吞作用的评估，速率和细胞内定位是最重要的方面。确定内吞作用的机制可以提供有价值的信息，包括进入肿瘤细胞的ADCs在肿瘤环境中的比例，以及ADC内吞作用目标抗原或目标癌细胞所需的时间。这些决定因素可以用来选择最佳的靶癌细胞、靶标抗原和最佳ADC组合。ADCs的细胞内定位可以提供诸如内吞作用后肿瘤细胞外排ADC的比例、溶酶体运输的速率限制步骤、肿瘤细胞中药物释放速率以及整个运输过程中不同连接子的稳定性等信息。

流式细胞仪通常用作确定ADCs内吞作用的方法。在4 °C下，ADCs可以特异性地结合到细胞表面靶标抗原，但不会被内吞。在37 °C下，细胞可以介导内吞作用从细胞表面摄入ADCs。因此，通过比较4 °C下细胞表面荧光强度变化与在37 °C下孵育后的荧光强度变化，可以间接计算ADC的内吞作用速率。

使用共聚焦显微镜可以可视化内吞作用后的ADCs。这种技术使用不同的荧光团标记ADC、有效载荷、细胞膜和包括溶酶体相关膜蛋白-1、网格蛋白重链和洞穴蛋白-1在内的细胞器。通过高分辨率共聚焦显微镜直接观察不同时间点ADC在细胞内的定位。

3.3.3.改善ADC内吞作用效率的问题和方法

目前开发中的大多数ADC以及所有上市的ADC都针对肿瘤细胞表面抗原，并依赖于内化作用以释放有效载荷，这强调了研究ADC内吞作用和提高内吞作用效率方法的重要性。ADC的内吞作用效率与抗原的内吞作用特性、抗原上的抗体结合位点和肿瘤细胞类型有关。抗体的内化速率、内化时间、循环和细胞内药物积累都是衡量和估计ADC内吞作用效果的关键参数。

Durbin等人评估了一种ADC针对EGFR过表达癌细胞系的内吞作用效果。他们发现，相同的ADC（Ab033）在A431细胞中的内化速率为0.047/min，在H441细胞中为0.15/min。此外，他们发现高达45%的内吞Ab033返回到细胞表面。幸运的是，尽管在24小时后循环，但单个肿瘤细胞中大约积累了5×10⁶个游离有毒药物分子。基于相同的抗体Ab033，他们准备了具有可切割或不可切割连接子的ADC。带有可切割连接子的Ab033 ADC与带有不可切割连接子的Ab033 ADC相比，显示出高有效载荷积累。这表明许多同时发生的不同条件影响抗体药物偶联物的内吞效率和治疗效果。

抗体结构的修饰可以用来提高内吞效率。双特异性抗体（能结合两个靶标）和双表位抗体（能结合单一靶标的两个位置）是两种提高ADC内吞效率的策略。

3.3.3.1.双特异性抗体。双特异性抗体可以同时结合两个目标抗原（适用的目标肿瘤细胞应在其表面表达这两种抗原）。具有高效内吞效率的抗原可以内化ADC，而不管另一个抗原的内吞效率低（通常低内吞效率的抗原是肿瘤标志物，而高内吞效率的抗原不必是肿瘤抗原）。例如，当针对快速内化的上皮细胞激酶A2（EphA2）和非内化高表达的活化白细胞细胞粘附分子（ALCAM）的抗体结合形成双特异性ADC时，进入肿瘤细胞的双特异性抗体数量超过单一单克隆抗体或两种抗体混合物，显示出双特异性依赖的放大效应。抗ALCAM结合域提供肿瘤特异性结合位点，而抗EphA2结合域可以促进内吞。少量内化的抗原EphA2诱导大量内化的ALCAM。在此基础上，构建了双特异性ADC。结果表明，双特异性ADC对体外和体内肿瘤细胞的杀伤效果优于单一特异性ADC，尽管这种策略是否可能对肿瘤特异性产生负面影响尚不清楚。

3.3.3.2.双表位抗体。双表位（或双表位）ADC不是针对两种抗原，而是通过抗体的两个Fab片段针对单一靶标的不同表位。目前，针对HER2的双表位ADC已经进行了临床研究，HER2是抗体结合后内化效率低下的抗原。Li等人准备了针对HER2上两个不重叠表位的双价双表位抗体，并随后准备了将双表位抗体和微管抑制剂偶联的ADC。他们发现双表位抗体诱导HER2受体聚集，并带来强大的内化、溶酶体运输和降解。体内研究表明其抗肿瘤活性优于T-DM1。

3.4.第四步 - ADC在目标细胞内释放有效载荷

3.4.1.ADC在溶酶体中处理

携带ADC的晚期内体与溶酶体融合，运输ADC进行降解，随后释放有效载荷（如图5，步骤4所示）。溶酶体通过H+-ATPase不断输入质子，维持pH 4.5至5.0的酸性环境。它们还富含蛋白水解酶，如组织蛋白酶和胶原酶。当ADC进入肿瘤细胞时，ADC的抗体部分已完成其使命。部分抗体将被细胞中的蛋白酶水解并分解成氨基酸。从内吞作用到降解，这个过程需要几个小时。在此期间，有效载荷将被释放并积累在细胞质中。释放机制由连接子的类型决定。

首个获批的ADC药物Mylotarg使用腙连接子技术。腙连接子是化学不稳定的连接子，它们连接到抗体的赖氨酸残基上，并由于血浆和细胞质之间的环境差异而释放有效载荷。腙连接子在酸性pH下断裂。通常，它们在血液的中性pH（7.3至7.5）下稳定，24小时内的降解率仅为约6%。进入肿瘤细胞后，晚期内体（pH 5.0至6.5）和溶酶体（pH 4.5至5.0）中的ADC迅速释放其有效载荷。24小时降解率可达97%。基于二硫键的连接子也是一类化学不稳定的连接子。二硫键在血浆中稳定。进入肿瘤细胞后，它接触到细胞质的强还原环境并释放有效载荷。二硫键还原需要硫醇辅因子，如还原性谷胱甘肽（GSH），或二硫键异构酶。细胞内GSH的浓度平均范围为0.5至10毫摩尔/升，而血液中GSH非常低，约为5微摩尔/升。

酶促连接子比二硫键和腙连接子更稳定。肽连接子是一种典型的酶促连接子，可以更好地控制ADC有效载荷的释放。由于血液的中性pH和内源性抑制剂，血液中的蛋白酶活性非常低，这确保了肽连接子在血液中的稳定性。肽连接子的半衰期通常为7至10天。ADC进入肿瘤细胞并运输到溶酶体后，其肽连接子将逐渐通过蛋白酶降解断裂并释放有效载荷。此外，β-葡萄糖苷酸连接子是一种酶切割的连接子，可被β-葡萄糖苷酶切割。这种酶在某些类型的肿瘤中过表达，而在细胞外环境中活性非常低。β-葡萄糖苷酸连接子的优点是其亲水性，可以减少ADC聚集。

目前，ADC中最常用的不可切割连接子是硫醚连接子，通过马来酰亚胺和巯基反应获得。在溶酶体中降解硫醚连接子后，释放含有赖氨酸的有效载荷。通常，硫醚连接子的半衰期约为7天，与可切割连接子相近。例如，上市的ADC T-DM1采用不可切割的硫醚连接子，旨在将有效载荷保留在肿瘤细胞内。此外，上市的ADC Blenrep采用不可切割的马来酰亚胺己酰连接子连接belantamab和MMAF。

3.4.2.连接子技术研究

连接子技术的研究主要集中在连接子稳定性确定、旧连接子优化、新连接子策略开发和偶联动力学模型绘制。体内ADC稳定性的确定是评估连接子的关键。最重要的检测方法是ELISA和LC-MS。抗体表面的赖氨酸残基含有氨基，由于其强亲核性，可以用作偶联位点。在最简单的偶联反应中，活性酯（O-琥珀酰亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺）可以直接与赖氨酸残基反应形成稳定的酰胺键。其他活性酯如羟基苯并三唑、氟苯或硝基苯衍生物也可用于形成连接子。这种偶联方法广泛用于不可切割连接子。

或者，可以使用两步偶联方法偶联抗体和有效载荷。在这种方法中，抗体的赖氨酸残基被修饰，添加连接子，然后将有效载荷偶联到连接子上。第二次偶联反应通常使用有效载荷中的硫醇基团。例如，T-DM1通过使用SMCC作为其连接子与抗体链接。制备后，需要进行ADC的DAR确定和结构表征。ADC的可用检测方法包括紫外-可见光谱法、疏水作用色谱（HIC）和LC-MS。

3.4.3.与连接子相关的问题和策略

通常，一个典型的抗体上有40个赖氨酸位点可用于偶联有效载荷，理论上给出约10⁶种ADC形式。IgG1只包含四个链间二硫键，其反应活性高于链内二硫键，并且可以用于修饰。二硫键断裂后，产生八个半胱氨酸残基作为潜在的连接位点。然而，使用切割后的半胱氨酸作为有效载荷结合位点将影响抗体的稳定性。一些早期的ADC是利用抗体表面的糖基团作为连接位点构建的，其优点是能够连接大量的有效载荷。然而，缺点在于无法控制连接位点和DAR（药物-抗体比率），导致连接位点覆盖了抗体特异性识别位点。结果，部分ADC无法结合目标抗原，或者过多的连接可能增加ADC的疏水性，导致疏水聚集和沉淀。早期开发的Mylotarg使用抗体上的赖氨酸来偶联有效载荷。由于抗体上赖氨酸的数量相对较多，DAR高达14，这使得Mylotarg的批间一致性和ADC多样性难以控制。目前，研究集中在减少ADC的异质性上。

位点特异性偶联技术用于将一定数量的有效载荷分子偶联到抗体的特定位点，确保制备的ADC的一致性，有利于提高疗效和减少毒性。基于酶的偶联是一个重要的例子。通过酶特异性底物催化，可以产生完全均质的ADC。常用的酶包括糖基转移酶、谷氨酰胺转移酶和β-半乳糖苷酶。所有IgG亚型的Fc片段都有一个N-糖基化的天冬酰胺（Asn297），可以用来进行糖基转移酶修饰，引入连接子和有效载荷。具体来说，β-N-乙酰葡萄糖苷酶用于断裂N-糖基化天冬酰胺上的寡糖，以暴露出修饰的活性位点（原始寡糖长度不固定且缺乏有效载荷结合位点）。然后使用β-N-乙酰葡萄糖苷酶突变体添加带有叠氮基有效载荷结合位点的寡糖。在此之后，可以通过叠氮化物通过双正交反应将有效载荷连接到寡糖上。在一项研究中，作者为ADC设计了一个β-半乳糖苷酶可切割的连接子。一个半乳糖苷连接子、单甲基奥瑞他汀E（MMAE）和半胱氨酸反应性曲妥珠单抗被偶联形成ADC。对ADC的评估，无论是体外还是体内，都发现与曲妥珠单抗emtansine相比，在小鼠中具有更优越的治疗效果。

在抗体制备过程中，可以通过遗传工程将非天然氨基酸添加到抗体中。引入非天然氨基酸的最大优点是，制备的抗体可以在这些残基处轻松完成特定的化学反应以连接有效载荷。最常见的方法是将一个终止密码子转变为编码密码子。这种方法还需要合成tRNA和tRNA合成酶。此外，通过遗传工程将抗体非抗原识别区域的氨基酸残基转化为半胱氨酸的策略也有报道。这种方法可以用来修饰抗体链中的二硫键以偶联有效载荷，而不会破坏链间二硫键或影响抗体的稳定性。

3.5.第五步 - 细胞毒性ADC有效载荷抑制肿瘤细胞生长

3.5.1.ADC有效载荷的作用机制和毒性

一旦ADC在溶酶体中降解，它们所携带的有效载荷就会释放到细胞质中，与其相应的靶标结合。通常情况下，对于中等效力的有效载荷，积累超过10⁶分子/细胞将杀死一个肿瘤细胞。最常见的靶标是细胞核中的DNA和细胞质中的微管。针对核DNA的药物包括阿霉素、二卡霉素和吡咯并苯并二氮杂卓（PBDs）。这些药物嵌入到DNA双螺旋结构的小沟中，使DNA断裂，导致细胞凋亡。针对微管的ADC有效载荷有两种：奥瑞他汀衍生物（包括MMAE和MMAF）和美登素衍生物（包括DM1和DM4）。超过60%的临床试验中的ADC使用微管抑制剂作为其有效载荷。与针对DNA的有效载荷相比，这些药物更好地限制了细胞生长。它们主要针对快速分裂的细胞的微管，阻止细胞周期，导致凋亡。ADC降解后释放到细胞质的小分子可以穿过细胞膜，进入相邻细胞并抑制增殖。旁观者效应有助于抑制异质性肿瘤中表达弱或无TSA的肿瘤细胞（如图5，步骤5所示），尽管同时如果邻近的正常细胞受到影响，它也可能带来负面影响。

3.5.1.1 微管抑制剂。微管聚合对于包括细胞内运输、有丝分裂和结构完整性维持在内的多种细胞过程至关重要。微管至少有五个已知的结合位点，包括长春花碱、秋水仙碱、紫杉醇、美替西胺和劳拉酰胺结合位点。针对微管的药物通过阻断有丝分裂纺锤体的分离，导致不稳定的细胞骨架结构，诱导细胞周期在G2/M阶段停滞，从而导致细胞死亡。微管的结构可以通过结合微管的β-亚基或α-β异二聚体来影响。美登素可以结合到延长的微管上，通过阻断微管异二聚体的形成来抑制微管的形成。具有这种机制的药物适用于快速增殖的细胞。因此，微管抑制剂对癌细胞特别具有细胞毒性，因为癌细胞的分裂和生长速度比大多数正常细胞快。这也可以减少对正常组织和细胞的非靶标杀伤。然而，微管抑制剂的早期释放可以杀死一些快速分裂的正常细胞，导致不良副作用。此外，静态和未分化的癌细胞，如癌症干细胞或肿瘤起始细胞，对微管抑制剂的敏感性较低，从而避免了杀伤并产生耐药性。值得注意的是，大多数小鼠异种移植模型包含的生长速度远快于正常人类肿瘤的肿瘤。因此，在动物实验中表现出强烈肿瘤杀伤活性的药物，并不一定在人类临床试验中显示出相同的疗效。

美登素是与利福霉素、格尔登霉素和cladosporin结构相似的细胞毒素，它们具有一个共同的十九元大环内酯结构。美登素及其衍生物是微管组装的强效抑制剂。它们可以通过与长春花碱结合位点上的微管结合，诱导中毒细胞的有丝分裂停滞，因此，美登素的机制与长春花碱相似。在低浓度下，微管动态不稳定性和细胞迁移受到抑制；在较高浓度下，微管组装和细胞分裂受到抑制。这些效应导致有丝分裂期间的抗增殖活性。美登素的ED50（有效剂量）范围为10^-5 μg/mL至10^-4μg/mL。美登素的过早释放可能导致神经毒性、胃肠道毒性、虚弱、恶心、呕吐和腹泻等副作用。

3.5.1.2.DNA损伤剂。DNA损伤剂在癌症化疗中的应用历史悠久。这些分子通过与DNA双螺旋结合发挥其细胞毒性作用。根据它们对DNA的作用机制，它们被分为四种类型：双链断裂剂（如阿霉素）、烷化剂（如PBDs）、插入剂（如卡利切阿霉素）和交联剂（如顺铂）。与针对微管的药物相比，DNA损伤剂作为ADC有效载荷有两个优点：（1）DNA损伤剂（pM IC50值）比针对微管的药物（nM IC50值）具有更强的细胞毒性，这使得ADC能够在较低剂量下杀死癌细胞，包括表达目标抗原较少的癌细胞；（2）DNA损伤剂可以杀死处于任何细胞周期阶段的肿瘤细胞（分裂或非分裂细胞）。这可以对增殖能力较弱的癌细胞产生细胞毒性，如癌症干细胞。此外，卡利切阿霉素可以插入到DNA的小沟中并诱导细胞凋亡。卡利切阿霉素的细胞毒性是标准化疗药物的100倍以上。在目前市场上的ADC药物中，Mylotarg和Besponsa都使用卡利切阿霉素作为其有效载荷。

3.5.2.ADC的代谢研究

从溶酶体中释放的有效载荷杀死肿瘤细胞。这方面的研究主要集中在ADC的代谢、有效载荷的毒性机制以及ADC的不良反应上。当ADC进入循环系统时，有效载荷会慢慢释放，平均DAR值会随时间减少，直到归零。DAR的变化率可以反映有效载荷从抗体释放的速率。同时，循环中细胞毒素分子的摩尔浓度会增加，这会影响疗效和安全性。ADC的代谢包括：（1）小分子及其代谢物的研究和（2）抗体及其代谢物的研究。这些研究有助于揭示ADC的毒性机制和代谢过程，以更好地了解这些分子，优化它们的设计，实现更好的治疗效果。

ELISA是ADC中抗体分子定性和定量分析的典型配体结合分析方法。通过这种方法可以方便、准确地测量ADC及其代谢物。这种分析的缺点是它只测量ADC抗体，而不是释放的有效载荷。此外，它只适用于已知代谢物的检测，不适用于未知代谢物。

LC-MS可以用来检测小分子有效载荷。随着分析方法和仪器灵敏度的提高，LC-MS可以用来分析ADC的DAR和有毒小分子的代谢。这种方法非常有益，特别是因为它能够识别新的代谢物。可以获得ADC上有效载荷的连接位点和连接数量。

3.5.3.ADC有效载荷的问题

3.5.3.1.有效载荷对ADC的影响。通常，用作ADC有效载荷的细胞毒素小分子药物本质上是疏水性的。有效载荷的疏水性影响ADC的物理和化学性质。过多的疏水细胞毒素分子与ADC结构的偶联使ADC容易聚集并变得不稳定。这不仅是由于疏水性，还因为抗体的二级和三级结构发生变化，从而影响构象稳定性。例如，ADC T-DM1（3.94天）的血清半衰期远短于其抗体曲妥珠单抗（18.3天）。此外，偶联位点和DAR的差异也影响ADC的药代动力学（PK）特性，导致ADC异质性和表征困难。相比之下，亲水性有效载荷减少了ADC聚集，但也降低了ADC膜通透性和旁观者效应。有效载荷的非靶效应和代谢直接影响ADC的功能。作为代谢酶（如细胞色素P450同工酶）或甚至转运体（如P-糖蛋白）的底物、抑制剂或诱导剂的有效载荷可能会影响ADC的代谢。

3.5.3.2.限制不良反应。ADC开发的一个关键研究点是限制非靶毒性。ADC的这种毒性主要由过早释放的有效载荷或在正常细胞中释放的有效载荷驱动。在血液中，ADC连接子可能会断裂（特别是可切割连接子），这可能导致毒性。通过非选择性内吞作用收集ADC的正常细胞也会产生毒性。此外，一些ADC会结合也表达目标抗原的非肿瘤细胞。已经有十几种针对各种抗原的ADC报告了眼科毒性，其中大多数在眼睛中的表达有限。这些不良反应包括视力模糊、角膜异常或干眼。大多数涉及的ADC含有MMAF或DM4，表明这些微管抑制剂有效载荷与眼科副作用的发展之间存在关系。据推测，这种效应至少部分是由于对居住在角膜缘的干细胞的损害。与MMAF相比，含有MMAE的ADC眼科毒性较小。然而，大多数基于MMAE的ADC具有中性粒细胞减少和周围神经病变等毒性效应。这些也是各种微管抑制剂的常见副作用。由于成熟的神经元不积极分裂，神经元细胞死亡与有丝分裂阻滞无关。相比之下，周围神经病变被认为是由对微管依赖性运输途径的损害引起的。基于PBDs的vadastuximab talirine (SGN-CD33A)的开发被FDA暂停，原因是其严重的肝毒性。在一项研究中，作者对70篇出版物进行了荟萃分析，以获得ADC的临床毒性信息。在分析中，发现MMAE ADCs有贫血、中性粒细胞减少和周围神经病变，而DM1有血小板减少和肝毒性，MMAF则有眼科毒性。另一个例子是，T-DM1可以结合到肝细胞表面的HER2，从而导致肝毒性。此外，T-DM1可以通过依赖FcγRIIa的方式内化到巨核细胞中，导致巨核细胞减少。血小板是由巨核细胞产生的，因此T-DM1治疗可能导致血小板减少。进入正常肺泡的ADC有可能引起间质性肺炎作为严重的不良反应。EGFR靶向治疗在一些患者中引起皮炎，尽管机制尚不清楚，但在EGFR高表达和低表达的肿瘤中都有观察到。这些不良反应被总结为非靶毒性，与有效载荷有关。总的来说，有必要研究新的化合物作为ADC的潜在有效载荷，以减少不良反应和非靶毒性的风险，同时提供相同或更好的杀死肿瘤细胞的效果。

4.当前ADC临床概况

ADCs在肿瘤治疗中的应用对于多种癌症类型的治疗方法充满希望。到目前为止，至少有十种ADC药物已经获得了FDA的批准（如表1所示）。其中，有六种ADC用于治疗血液恶性肿瘤。与实体瘤相比，血液恶性肿瘤的目标抗原更容易被循环中的ADC接触。淋巴瘤和乳腺癌是研究最多的两种癌症。有三种ADC被批准用于乳腺癌，另外两种用于淋巴瘤。这十种获批的ADC（例如，CD33、CD30、CD22）的抗原是肿瘤细胞表面的分子，具有高度受限的分布模式，这避免了ADC针对造血组织和多能干细胞，提供了更好的特异性和耐受性。

在临床试验中的ADC数量正在迅速增加。目前，有超过280项与ADC相关的临床试验在不同阶段研究大约138种不同的ADC，用于治疗大约60种癌症（https://clinicaltrials.gov）。全球的制药公司对ADC在临床研究的积极发展做出了贡献，为抗癌斗争带来了新的希望。表2总结了近年来一些在临床试验中的ADC，重点关注肿瘤类型、有效载荷、连接子类型、赞助商和临床状态。

在临床使用的药物中，Mylotarg由Wyeth开发，并于2000年5月首次获得FDA批准。2010年，辉瑞公司因静脉闭塞病的副作用导致患者早逝而将Mylotarg撤出市场。2014年，对五项随机临床试验的数据分析发现，低剂量Mylotarg相比支持性治疗改善了患者的生存率。基于这些数据，2017年9月，FDA再次批准其用于治疗新诊断的表达CD33抗原的成人急性髓系白血病患者。

Adcetris最初于2011年获得批准用于治疗霍奇金淋巴瘤（HL）和系统性间变性大细胞淋巴瘤（sALCL）。此外，它在2018年11月被批准作为一线治疗药物，用于治疗CD30阳性的成人外周T细胞淋巴瘤（PTCL）（NCT01777152, NCT01578499 和 NCT01100502）。围绕HL、sALCL和PTCL，Adcetris已经获得了六项治疗适应症，展示了快速的适应症扩展。

Kadcyla于2013年获得批准用于治疗HER2阳性乳腺癌。目前，它是唯一一种在104个国家（包括美国和欧盟成员国）作为单药疗法获批用于HER2阳性转移性乳腺癌患者的ADC，这些患者之前已经接受过赫赛汀和/或紫杉醇化疗（NCT00829166）。

Besponsa是辉瑞公司的第二种ADC。它于2017年上市，针对CD22用于治疗复发/难治性B细胞前体急性淋巴细胞性白血病（NCT01564784）。Besponsa使用与Mylotarg相同的酸不稳定的腙键连接子。Lumoxiti（Moxetumomab pasudotox）于2018年9月获得批准，用于治疗毛细胞白血病患者。80%的患者（64人）在治疗后180天内实现了肿瘤完全缓解（NCT01829711）。最常见的不良反应是组织水肿和肾衰竭。

Polivy（polatuzumab vedotin）于2019年6月获得批准，用于至少接受过两种其他治疗的B细胞淋巴瘤患者。由于在临床试验（NCT02257567）中的良好治疗效果，它获得了批准。Padcev（enfortumab vedotin）于2019年12月获得批准，用于治疗局部晚期或转移性尿路上皮癌。在涉及125名患者的临床试验中，Padcev带来了44%的客观反应率（ORR），12个完全反应和7.6个月的中位持续反应时间，为其批准做出了贡献（NCT03219333）。最常见的副作用是高血糖、周围神经病变和眼病。Enhertu（trastuzumab deruxtecan）于2019年12月获得批准，用于接受过至少两种其他治疗的HER2阳性乳腺癌患者。在临床试验中，60.3%的ORR反映了显著的肿瘤缩小，中位无复发时间为14.8个月，支持其批准（NCT03248492）。Enhertu的常见不良反应是中性粒细胞减少和左心室功能障碍。严重不良反应包括间质性肺病和胚胎-胎儿毒性。

Trodelvy（sacituzumab govitecan）于2020年4月获得FDA批准，用于接受过至少两种其他治疗的晚期三阴性乳腺癌患者。在临床研究（NCT01631552）中，33.3%的ORR和7.7个月的中位无复发时间。最常见的不良反应包括恶心和呕吐、中性粒细胞减少、腹泻和疲劳。Blenrep（bellantamab mafodotin）于2020年8月获得FDA批准，用于治疗复发性多发性骨髓瘤。在其临床研究（NCT03525678）中，观察到良好的结果，有31%的ORR和73%的患者超过六个月没有复发。最常见的不良反应包括角膜疾病（眼科检查时角膜上皮变化）、视力丧失和恶心。这些临床研究和专利概述了ADCs的成功应用，同时也指出了当前ADCs的一些缺点。

5.结论和未来方向 

ADCs被认为是治疗癌症的令人兴奋和有希望的方法（Tsuchikama & An, 2016）。在临床试验中注册的ADC数量持续增长。这与ADC抗体目标范围的扩大、连接子技术的优化和新有效载荷的创新密切相关。ADCs的研究正处于一个转型期。旧的偶联方法正在让位于更新的点特异性修饰方法，低毒性有效载荷正在让位于超高效载荷，小鼠来源的抗体正在让位于完全人源化抗体，等等。更好地理解ADCs体内处理的所有方面的知识和从20年的临床经验中吸取教训对于开发更有效的ADC至关重要。随着2019年三种ADC的批准，它们已经引起了全球的关注。事实上，我们正处于ADC繁荣的时代，大量新兴的ADC正在开发中或处于临床试验阶段。值得注意的是，ADCs在临床、临床试验和研究环境中的增加，不仅反映了医生和制药公司对这一领域日益增长的兴趣和信心，也突出了ADCs为癌症患者提供的价值和益处。目前，已有十种ADC证明了其作为治疗药物的有效性，并获得了FDA的批准用于治疗癌症（表1）。未来，预计会有更多ADC药物获得批准上市，用于治疗更多类型的癌症（如表2所示）。

ADCs具有将细胞毒素药物特异性地输送到癌细胞中的明显优势，从而减少了这些药物对健康组织的毒性。早期研究尝试了多种天然毒素作为ADCs的有效载荷。然而，这些毒素的细胞毒性不够强，在动物和临床试验中都缺乏有效性。在过去的20年里，人们投入了巨大的努力来开发超级毒素，特别是针对细胞内靶标的毒素。目前，已经开发出许多超级毒素及其衍生物。这些通常针对微管或DNA。微管抑制剂，如奥瑞他汀和美登素，广泛应用于ADC开发，并选择性地针对快速分裂的癌细胞，对非分裂的健康细胞造成的损害较小。DNA损伤剂，如卡利切阿霉素和PBDs，可以诱导所有细胞（包括非分裂的癌细胞）凋亡。然而，尽管在有效载荷的有效性方面取得了进展，ADCs的替代性有效载荷骨架类型并未增加，大多数细胞毒素药物都是以前核心骨架的衍生物。因此，在下一代ADCs中，有必要开发具有多样化靶标、作用机制和减少副作用的高效有效载荷的新骨架。我们期待复杂的天然产物库将继续成为ADC有效载荷的新型细胞毒素分子的极好来源。

ADC开发中的一个核心难题在于连接子技术。传统的连接子技术通常通过抗体的二硫键、半胱氨酸或赖氨酸残基偶联药物。大约20个潜在可结合的赖氨酸残基和随机偶联导致了数百万种不同的ADC形式的生产。体内异质性ADCs的药代动力学特性差异很大，因此，工业生产面临着确保批次间样本一致性的极大挑战。ADCs的这种异质性是获得FDA批准的一个障碍。因此，许多生产ADC的公司正在开发位点特异性连接子技术。位点特异性连接子技术可以确保固定数量的药物分子偶联到抗体的特定位点，这在很大程度上可以确保药物的均质性和批量生产稳定性。此外，它可以准确地控制DAR值在2到4之间。目前，位点特异性ADC技术主要依赖于半胱氨酸的工程改造、非天然氨基酸的修饰、硒半胱氨酸替代或位点特异性酶催化。

展望未来，创新和低成本的将细胞毒素有效载荷偶联到抗体的方法无疑将受到关注。

ADC开发领域目前面临的挑战是什么？尽管自ADCs最初开发以来已经过去了35年多，但FDA迄今为止仅批准了十种ADC药物。几种ADC在临床前研究中显示出巨大潜力，但在临床试验中表现不佳。毒性和不完整的表征数据是导致这些失败的两个主要因素。ADCs的性质比单克隆抗体更复杂，需要额外的数据来支持临床试验。这包括1）完整的ADC结构数据：不同批次ADCs的不同表征（质谱、肽图、糖基化、圆二色谱、差示扫描量热法等）、DAR值、偶联位点、细胞毒素分布均匀性等；2）ADC的有效性：抗原结合亲和力、内化所需的时间、ADC在血液循环中的时间定位、ADC在不同癌症中的细胞内进入比例、ADC的效应以及与其他药物联合疗法的效果；3）不良反应分析：副作用的原因和严重程度、对表达目标抗原较低的正常组织的毒性、连接子过早断裂引起的不良反应（早期毒素释放）以及非特异性内吞作用在非肿瘤组织中引起的毒性。

ADC开发的未来可能性是什么？过去十年开发的大量ADC技术为针对特定目标的ADC设计创造了广泛的机会。结合新ADC的批准，新技术可能在未来几年大放异彩。这些开发领域可能包括：1）针对肿瘤微环境的ADC。肿瘤微环境中的几种特征和靶标不论肿瘤类型都很常见，这可以大大拓宽ADC的治疗窗口并提高其抗肿瘤活性。2）新形式的ADC，如X-药物缀合物（XDC，如肽和小分子）。近年来的许多出版物揭示了ADC类肽-药物缀合物、小分子-药物缀合物和纳米粒子-药物缀合物的新尝试。3）重组DNA技术以及其他跨学科和多学科方法，可以带来低成本的位点特异性有效载荷偶联。4）没有直接细胞毒性的有效载荷，如可能引导免疫系统针对癌细胞的有效载荷。总的来说，ADC开发已经花费了数十年的时间，发表了数以千计的ADC论文，重要的是迄今为止已经批准了十种ADC，所有这些都预示着ADC的未来繁荣。

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