对超声异常的胎儿进行全外显子测序：扩充了人类在胎儿发育过程中的遗传病知识

在美国，3％的活产儿存在先天畸形。先天畸形同时导致约三分之一的胎儿围产期死亡及20％的婴儿期疾病的发生。如果把孕期胎儿结构异常也包括进来，各类先天畸形导致的流产、死胎或胎儿停止发育的发生率将更高。染色体异常，单基因或多基因疾病，以及宫内环境是公认的导致出生缺陷的主要原因。尽管如此，仍有许多先天缺陷无法确定病因。

胎儿超声异常需要增加额外的产前评估。通过有创方式获得的绒毛膜或羊水样本可以用来进行基因检测从而辅助疾病的诊断。aCGH能够检测染色体非整倍性变异、非平衡异位以及染色体拷贝数变异等，这些异常也可以通过G显带核型分析完成。但是在超声异常的胎儿中，aCGH的检出率相比传统核型分析约高6%。如果在超声能够明确胎儿的异常极可能是某一类疾病时，通常会首选单基因检测或panel检测来进行遗传诊断。虽然aCGH的检出率在不断提高，单基因检测及panel检测的有效性也在不断提高，仍有许多超声异常的胎儿不能被诊断。而如果没有明确的诊断结果，对于胎儿预后及再受孕中畸形的再发风险均无法提供准确的遗传咨询。

全外显子测序（WES）已被广泛应用于一线检测方法未能找出致病原因的儿科及成人遗传疾病的临床诊断，同时由于其更高效的临床诊断价值，越来越多地被推荐为临床首选分子检测平台。同时，WES还能够检测出与某一临床表型相关的新致病基因，例如，TKT基因的致病性变异被发现与矮小，个体发育迟缓和先天性心脏缺陷相关；CTBP1基因的致病性变异被发现与个体发育迟缓，肌张力减退，共济失调和牙釉质发育不全相关。我们之前有报道过WES在儿科及成人疑似遗传疾病诊断中的检出率约为28.8％，其中单先证者检测的检出率为24％，trio家系检测的检出率为31％，其他实验室报道的检出率为22％~26％。

超声异常胎儿样本的WES检测不同于儿科及成人，可能是因为样本量较小导致，以往的研究报道中检出率变化范围较大，从10％到57％不等。我们本次对84例死胎样本进行WES检测，以期扩展已知遗传疾病的临床表型，同时辅助超声对异常胎儿进行诊断。本研究中的样本量是目前该类研究中最大的。

我们收集了2012年10月至2016年3月期间超声异常提示为死胎或因超声异常终止妊娠的胚胎样本84例。对这些已故胎儿及家人的样本进行 WES测序。

本研究的84例样本中，有63％（N = 53）例是直接获得DNA样本，而剩余病例的DNA是提取自不同来源的胚胎组织，包括培养的羊膜细胞（11％，N = 9），脐带血（9.5％，N = 8），培养的流产物细胞（9.5％，N = 8），流产物（5％，N = 4）和羊水（2％，N = 2）。亲本DNA提取自外周血或口腔脱落细胞。如果父母及之前受累胎儿样本都可用，临床医生鼓励父母把这些样本都提供用于检测分析。检测出的致病变异均会一代测序验证。本研究中的家系均未在之前的CNV检测中被检出阳性。各家系内的亲子关系均利用WES数据采用KING软件进行验证。

胎儿的异常表型分别通过当时的产前影像检查和尸解检查获得，由于各样本的表型描述方式并不统一，我们将这些描述结果统一经过HPO、HGMD及OMIM矫正，用于WES数据后续的关联分析。检出的变异，参照《2015 ACMG标准和指南:序列变异的解释》中的标准进行致病等级的划分。当在一个样本中发现多个疑似的致病变异时，选择其中致病等级最高的变异用于结果评估。检测中的次要发现报告标准，参照2013 ACMG 关于测序中次要发现的报告标准，依据其中的56个基因列表进行报告，如果父母要求不报告则不予报告。次要发现的报告不影响致病变异的等级评估，检测结果按以下四个等级进行分类：

阳性结果 ：检测出该表型已知致病基因的致病变异或可能致病变异。

可能阳性 ：检测出该表型已知致病基因上的变异，包括新发现的变异，变异类型可能是错义变异、框内插入或缺失，这类导致的表型与先证者表型有重合，该分类中还包括隐性致病基因的单杂合变异。

仅有候选基因 ：检测出新的候选基因中的变异。这些变异未在人类疾病中有致病性报道，但有模式生物的功能研究及一些其他体外功能研究表明其有害性，或是软件预测有害、保守性预测为保守序列等，该类变异致病性还需进一步的证据证实。

阴性结果 ：未检测出可能的致病变异。

我们采用WES检测分析了84例死胎样本，其中29例（34％）仅有先证者样本，4（5％）例同时提供了母亲的样本，45例（54％）有trio（一家三口）样本，6例（7％）有quads（一家四口）样本。经WES数据分析，84例样本中55％（N = 46）男性，45％（N = 38）女性。有3例分析出的性别与表型不一致，1例46,XX具有雄性表型，1例46,XY具有女性表型，以及1例46,XY有不明显的外阴。

84例样本68例（80％）做过核型和/或基因芯片分析，其中46例（68％）同时做了核型和基因芯片分析，4例（6％）仅做了核型分析，18例（26％）仅做了基因芯片分析。这68例的CNV检测结果中，除了2例检测出父源的VUS微缺失外，其他样本均正常。此外，

14例（17％）进行过常见遗传病的单基因或panel检测，检测内容包括Noonan综合征、水肿、先天性肾病综合征等，均未检测出阳性。样本的临床信息包括诊断咨询记录、超声报告、磁共振报告、超声心动图报告及尸检报告等。

本研究WES分析中，17例（20％）检出阳性结果，38例（45％）检出可能与表型相关的阳性结果，22例（26％）未检出可能致病的变异，7（9％）例检出候选基因。相较于仅有先证者样本病例的14％（4/29）的检出率，trio家系检出率24％（11/45）。 在84例死胎的家系中有27例的家系之前有过死胎情况，这27例有3例（11％）阳性，11例（41％）检出可能与表型相关的阳性结果，2例（7％）只检出候选基因，1例（41％）为阴性。基因芯片检测阴性结果的样本中23％（15/64）的WES检测结果为阳性。未检出CNV变异的样本（核型和/或基因芯片）中24％（16/68）的WES检测结果为阳性。检测中有2例检出ACMG指南中提出应该作为次要发现报告的与心律失常相关的基因。中枢神经系统异常在超声异常出现频率最高（37％，n = 31），其次是积水/水肿（36％，n = 30）和心血管异常（31％，n = 26）。WES检测在多发性先天畸形中的检出率20％（10/52）和单一型先天畸形中的检出率21％（7/32）无显著差异。