Plus深读 | TET介导的拟南芥甲基化组的表观突变(epimutagenesis)

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-018-03289-7

植物基因启动子中的DNA甲基化有时会导致转录抑制，并且甲基转移酶突变体中DNA甲基化的完全丧失将会导致基因表达的改变以及严重的发育缺陷。操纵植物甲基化组（methylomes）产生具有独特表观基因修饰的个体在育种和研究方面具有重要的意义。来自Georgia大学的Robert J. Schmitz和来自Chicago大学的何川课题组，共同开发了名为“表观突变”（epimutagenesis）的技术，即通过对拟南芥基因组的随机去甲基化快速产生DNA的甲基化变异。该技术通过在拟南芥中表达人类ten–eleven translocation（TET）酶（DNA去甲基化酶），产生可遗传给后代的广泛的基因组低甲基化，以此来模拟植物中DNA甲基转移酶met1的突变体。将epimutagenesis技术应用于农业上的重要作物，可导致先前由于DNA甲基化而沉默的等位基因的差异表达，从而揭示隐藏的表型变异。

实验结果

1. 在拟南芥中过表达TET1使基因组低甲基化

首先， 本文作者构建了在CaMV35S启动子控制下表达人类TET1蛋白催化结构域（hTET1cd，残基位置1418-2136）的转基因拟南芥，并对两株独立衍生的转基因拟南芥（35S:TET1-1和35S:TET1-2）进行了全基因组测序（whole-genome bisulfite sequencing, WGBS）。WGBS结果显示：1）相比于CHG和CHH甲基化，hTET1cd表达主要对CG甲基化（mCG）产生影响：与野生型（mCG平均水平18.2%）和met1突变（mCG平均水平0.5%）个体相比， hTET1cd的表达导致了基因组中等水平的CG甲基化（mCG平均水平分别降低至35S:TET1-1的8.9％和35S:TET1-2的6.9％， 图1a）；2）在基因和转座子处都观察到mCG的强烈减少和mCHG / mCHH的轻度减少（图1c-1i）；3）低甲基化现象在基因中比在转座子中更显著（图1e-1f, 补充数据1-2）。

2. TET1介导的DNA去甲基化被证实可模拟met1突变体

为评估hTET1cd表达对全基因组的影响，作者随后对差异甲基化区域（differentially methylated regions, DMR）进行了系统分析, 共鉴定出56,283个CG DMRs，其中38.7％位于基因间序列（Intergenic）中， 53.7％与基因重叠，7.6％位于启动子区域（位于基因上游≤1kb）。 与在met1突变体中观察到的结果类似， hTET1cd表达的主要作用是诱导CG低甲基化。在35S:TET1-1和35S:TET1-2中, 分别有12,641和20,601个DMRs上mCG降低超过50%；但整体上hTET1cd过表达引起的mCG降低程度仍低于met1突变体。

过往对met1甲基化组的研究曾揭示了一个CG低甲基化区域亚群中mCHG/mCHH的缺失17。在这些基因位点上，DNA甲基化能够稳定地被消除。这些位点是epimutagenesis的理想目标，因为1）与单独的mCG相比，同时具有三种类型的甲基化位点被证明更频繁地与基因的转录抑制相关；2）这些位点上低甲基化的长期稳定性能够促进可遗传的转录改变。为了确定如果mCG被耗尽，上述区域中有多少位点易丢失非CG甲基化，作者在野生型和TET1转基因个体中创建了mCHG和mCHH水平的频率分布（图1h，i）。在35S:TET1-1和35S:TET1-2中，分别有2341和3447个区域失去了超过10％的mCHG，其中有约70%的位点与met1变异体中mCHG的下降位点重合。同理，分别有2475和3379个区域失去了超过5％的mCHH，其中有超过75%的位点与met1变异体中mCHH的下降位点重合。值得注意的是，与模型植物拟南芥相比，水稻作物基因组中含有更多mCG, mCHG和mCHH介导的沉默靶点，因而hTET1cd的异位表达是创造epiRILs的一种可行方法。

图1. 在拟南芥中过表达hTET1cd介导的CG, CHG和CHH去甲基化

3. TET1介导的CHG甲基化改变

由于histone 3 lysine 9（H3K9）去甲基酶 IBM1 第七内含子上的甲基化缺失，met1基因的突变也导致了基因体CHG位点的高甲基化。IBM1第七内含子上的甲基化缺失导致了 IBM1 的选择性剪接， 最终产生非功能性基因产物（IBM1-S），进而导致了H3K9二甲基化（H3K9me2）在整个基因组中的异位积累。与在met1变异体中观察到的结果一致，IBM1的第七内含子同样在35S:TET1-1和35S:TET1-2中被低甲基化（图2a）。 随后，作者将35S:TET1-2分别繁殖两代和三代得到35S:TET1-2 ^T5 和35S:TET1-2 ^T6 。RT-qPCR结果证实了IBM1-S转录物丰度在35S:TET1-2T6中的增加，进而引发了gene body methylated（gbM）位点上的CHG超甲基化（图2b）。为了测试功能性IBM1对H3K9me2降低的影响，作者对35S:TET1-2 ^T6 中的H3K9me2进行了染色质免疫沉淀（ChIP），结果显示gbM位点上H3K9me2的细微增加对应了CHG的超甲基化（图2d）。

为了进一步表征CHG的差异性甲基化，作者将在35S:TET1-2T5鉴定出的CHG DMRs根据其在野生型个体中的DNA甲基化状态分为三组。 在鉴定出的9917例CHG DMRs中， 1460个DMR位于gbM位点， 584个DMR位于非甲基化区域， 6940个DMR位于RNA-directed DNA methylated（RdDM）区域（图2e-g）。 有趣的是，在gbM位点上的35S：TET1-2T5 CHG DMRs有1409（96.5％）例表现为CHG超甲基化；而在RdDM区域中的CHG DMRs有2680（38.6％）例表现为CHG甲基化缺失，仅有825（11.9％）例表现为获得CHG甲基化。另外，有503个（86.1％）在野生型中未被甲基化的位点在35S:TET1中获得了mCHG, mCG和mCHH的甲基化。上述结果表明，epimutagenesis技术可同时诱导DNA甲基化在基因组水平上的增加和减少。

为了表征hTET1cd介导的甲基化组变化对基因表达的影响，作者分别对野生型和TET1转基因组的叶组织进行了RNA测序（RNA-seq）。 与野生型相比，在35S:TET1-1和35S:TET1-2中分别鉴定出629和736个上调基因， 其中176和260个基因与CG DMRs重叠。另一方面，在35S:TET1-1和35S:TET1-2中分别鉴定出1277和1428个下调基因，其中268和324个与CG DMRs重叠。 值得注意的是，在35S:TET1-1和35S:TET1-2中观测到的转录组变化与met1和ibm1变异体相比存在较高程度的重叠（图2h，i）。综上，在拟南芥中表达hTET1cd可以有效调控基因表达， 进而获得隐藏的等位变异来源的转基因植物株。

图2. 在转基因拟南芥35S:TET1中CHG甲基化水平的整体波动

4. TET1表达导致花卉转变的延迟（晚花表型）

在35S:TET1转基因植物中， 作者观察到从营养生长到生殖生长发育转变的延迟（图3a，b）。 以往研究发现在met1突变体 ^[7] 中， 晚花表型与 FLOWERING WAGENINGEN（FWA） 的去甲基化相关。 与 met1 突变体一致， 35S:TET1中 FWA 上的甲基化（CG， CHG和CHH）也被完全消除（图3c），其甲基化损失与FWA表达的增加相关（图3c, 3d）。FWA可限制成花素信号移动至茎尖，进而导致晚花表型。 综上， hTET1cd通过消除序列背景（CG，CHG和CHH位点）中一些区域的甲基化而导致表型变异。

图3. 转基因拟南芥35S:TET1表现出晚花表型

5. TET1介导的去甲基化是跨代遗传的

为了评估TET1介导的去甲基化的稳定性和遗传性，作者将表达35S:TET1的T1个体自体受精，通过等位基因分离使hTET1cd转基因丧失。值得注意的是，无转基因的35S:TET1-1 T2个体恢复到正常开花表型，其整体甲基化水平与野生型非常相似（图4a）。另一方面，保留转基因的T2个体则显示出与T1亲本相似的CG甲基化水平。在无转基因的T2个体中，CG位点的去甲基化在基因上被部分遗传，而在转座子上则发生了相当活跃的再甲基化（图4b-f）。

图4. 转基因拟南芥35S:TET1 个体的跨代去甲基化概况

为确定在分生组织(meristematic tissue)中增强hTET1cd的异位表达是否会增加去甲基化对无转基因后代的种系透射率，作者进一步构建了在ACTIN2（ACT2）启动子控制下表达superfolder GFP (sfGFP)-hTET1cd的转基因拟南芥。 ACT2启动子已被证明在包括分生组织在内的所有幼体植物组织中都具有活性。与35S:hTET1cd相比，ACT2:sfGFP-hTET1cd T1群体的晚开花表型增强了27倍，说明在拟南芥中sfGFP-TET1cd融合蛋白具有相当高的活性（图5a）。 同时，在四株独立的ACT2:TET1 T1个体中约鉴定出68,260个CG DMRs，9235个CHG DMRs和2793个CHH DMRs，其DMR数目与35S:TET1相比急剧增加。

为进一步评估epimutagenesis介导的基因组去甲基化的遗传性，作者对包含和缺乏转基因hTET1cd并具备晚花表型的ACT2:TET1 T2子代进行了深入研究。保留和缺乏转基因的ACT2:TET1 T2个体均显示出晚花表型，TET1异位表达和FWA基因甲基化的缺失。有趣的是，无论转基因是否存在，其mCG的减少均能保持在稳定水平并被遗传，进一步证实了ACT2:TET1个体中的去甲基化活性高于35S:TET1（图5b-f）。与35S:TET1相比，晚开花表型在缺乏转基因的ACT2:TET1 T2个体中能够稳定遗传的原因还有待研究，推测可能是启动子强度和细胞类型特异性共同作用导致了上述现象。综上，上述结果证明了TET1介导的去甲基化的稳定遗传和在缺乏转基因情况下的晚花表型。

图5. 以ACT2为启动子的ACT2:TET1 转基因拟南芥的去甲基化概况

讨论和思考

1. 人类TET1蛋白的催化结构域在拟南芥中的表达导致CG甲基化的广泛丧失。 基于此开发的“epimutagenesis”技术，可在作物中产生可遗传给后代的广泛的基因组低甲基化，从而揭示作物中隐藏的表型变异。与epiRILs技术不同，epimutagenesis不再需要构建具有高致死率的DNA甲基转移酶突变体，是构建方法上的巨大进步。

2. 除了epimutagenesis， hTET1cd也可与序列特异性DNA结合蛋白（如dCas9）结合使用，以调控植物基因组中的DNA去甲基化。该方法已经在哺乳动物系统里得到初步证实 ^[9,10] 。

3. 与哺乳动物基因组中DNA甲基化的遗传模式不同，开花植物基因组中的DNA甲基化状态可通过减数分裂得到稳定的遗传。 。该特性使其成为研究epialleles的理想模型：一旦诱导产生新的甲基化状态，即可在随后的世代中被遗传。应用epimutagenesis和TET调控重要作物的DNA甲基化状态将是未来研究的一个有趣领域。

   
   

参考文献

1. Law, J. A. & Jacobsen, S. E. Establishing, maintaining and modifying DNA methylation patterns in plants and animals. Nat. Rev. Genet. 11, 204–220 (2010).

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