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Protein & Cell | 夏斌/段博合作建立实时定量体外转录调控研究体系QRIVTA

BioArt · 公众号 · 生物 · 2024-11-07 08:33

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体外转录实验被广泛用于基因表达调控，药物发现，和体外RNA合成等多个研究领域。传统的体外转录实验需要在转录过程中引入放射性同位素标记的rNTPs用于后续的电泳分析。其操作流程较为复杂，同时还存在一定安全风险, 并且只能对结果进行定性或者半定量分析。近年来，研究人员提出了一些策略用于开发基于荧光检测的实时体外转录实验，例如通过分子信标，RNA适配体等策略来检测转录体系中不断生成的RNA。实时体外转录实验能够精确地进行定量分析，并且具有较高的通量和相对简便的实验流程。

尽管具有这些优点，目前实时体外转录实验仍然没有被很好的完善，并且很少被用于体外转录调控研究中。导致这一问题的一个主要原因就是缺乏一套标准有效的工作流程和一套精确的定量分析方法，以确保实验数据具有良好的重复性，重现性以及可比性。

近日，北京大学的夏斌教授团队及苏州大学的段博副教授在 Protein & Cell 杂志在线发表了题为 Quantitative Real-time in vitro Transcription Assay (QRIVTA) for Transcriptional Regulation Studies 的研究论文。该研究以大肠杆菌全局转录调控因子H-NS对其靶基因 LEE5 操纵子的转录抑制作为模式系统，综合分子信标和RNA适配体两种荧光检测策略，建立并优化了一套实时定量体外转录调控研究体系，包括其具体的工作流程和定量分析方法。

研究者选用了超螺旋质粒作为体外转录的模板，以更好地模拟生理条件下的转录过程。通过对质粒中目标基因的转录效率及终止效率等的探究和评价，研究者对适用于体外转录调控研究的质粒设计进行了优化。研究者系统地评估了基于分子信标以及RNA适配体检测策略的检测灵敏度和特异性，并且展示了针对分子信标检测策略的优化方法，包括分子信标本身及其对应互补序列的设计。

研究发现，使用超螺旋质粒作为体外转录的模板时，即使在使用过量的RNA聚合酶底物rNTPs和分子信标的条件下，无论使用分子信标还是RNA适配体检测策略，实时体外转录实验中的荧光生成速率均随着时间在不断衰减。而使用线性化的或缺刻的质粒作为体外转录的模板时，实验的荧光强度表现为随时间线性增长。这些结果表明，荧光生成速率随时间的不断衰减的现象很可能与超螺旋质粒的拓扑结构性质相关。研究者进一步发现，荧光生成速率由一个随时间衰减的速率 v _d ( t )，以及一个不随时间变化的速率 v _c 组成。研究者提出了一个新公式（Equation 2）用于精准地拟合这些荧光数据，以提取荧光生成初速率（ v ₀ ），以及其它的一些动力学参数，用于表征整个体系的转录效率。

综合所有实验优化和该定量分析方法，研究者建立了一种高效，准确的实时定量体外转录调控研究体系QRIVTA。基于该体系，研究者成功地重现并定量分析了H-NS蛋白在超螺旋质粒背景下抑制其靶基因转录的浓度和温度依赖性效应。此外，研究者还表明了通过不同的荧光检测策略（基于分子信标或RNA适配体）测定的H-NS对超螺旋质粒中靶基因的转录抑制能力是一致的，进一步证实了QRIVTA的可靠性。

QRIVTA可以通过常规的RT-PCR仪器在96-或384-孔板中进行，使得研究人员以较高的通量，准确定量地探究各种调控转录过程的内在（模板架构或启动子强度等）以及外在（转录因子、小分子抑制剂及溶液条件等）因素的影响。此外，QRIVTA还可以被应用于合成生物学及新药研发等多个领域的研究工作中。值得注意的是，不同的实验操作可能会显著影响检测到的实时荧光数据的动力学性质，从而造成较差的数据质量。因此，在本论文的附件中，研究者还提供一套详细的QRIVTA实验指南，以期帮助更多的研究人员顺利有效地利用QRIVTA开展相关研究工作。

北京大学夏斌教授与苏州大学段博副教授为本论文共同通讯作者，北京大学生命科学学院博士研究生刘番为本论文第一作者。

原文链接：

https://doi.org/10.1093/procel/pwae054

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