Science长文∣向华/李明团队揭示护卫CRISPR-Cas的全新毒素-抗毒素RNA系统

CRISPR-Cas 系统在微生物基因组中稳定性维持是其抗病毒功能实现的关键基础。一方面， CRISPR-Cas 系统具有自我免疫的风险，并可能阻碍有益外源基因的获取，因此可对宿主细胞造成适合度代价（ fitness cost ）而可能在进化过程中频繁丢失。另一方面，微生物宿主与其病毒的“军备竞赛”中， CRISPR-Cas 系统也会成为病毒反攻（ Anti-CRISPR ）的目标而丧失功能。面对多重的进化压力和适应性挑战， CRISPR-Cas 系统为何能在微生物中广泛存在（存在于约 90% 的古菌和 40% 细菌中）并发挥其功能？在微生物宿主基因组中是否存在一类保护 CRISPR-Cas 功能但至今尚未被揭示的 “ 暗物质 ” ？这是科学家长期关注而又未能充分认识的前沿科学问题。

经过近 7 年的探索，他们最终在 cas6 与 cas8 之间一段仅 311 bp 的基因间区内发现了一类全新的小 RNA 毒素 - 抗毒素系统，分别命名为 CreT （ RNA 毒素）和 CreA （ RNA 抗毒素）。 CreTA 通过与 CRISPR 效应复合物 4 个编码基因的结构与功能的偶联，守护了 CRISPR-Cas 系统的稳定性（图１）。

主要创新性发现：

１、首次发现受 Cascade 蛋白控制的小 RNA 毒素

该团队首先通过敲除 cas6 和 cas8 基因间区的 311 bp 序列获得 ∆TA 菌株，然后基于该菌株成功获得了 Cascade 各单基因缺失菌株。接着，他们利用携带这一段 311 bp 基因间区的质粒（ pTA ）转化各突变株，发现在 Cascade 基因缺失（ ∆ cas5-8 ）或其单基因缺失 (∆TA∆ cas5/6/7/8 ) 的菌株中， pTA 均表现出细胞毒性（转化效率降低约 4 个数量级），而在 Cascade 基因完整表达的 ∆TA 菌株中， pTA 的细胞毒性则被完全抑制。上述系列实验表明， 311 bp 的基因间区产生了某种未知毒素，命名为 Cascade 抑制型毒素（ C ascade- re pressed T oxin ），即 CreT （图 2A 和 2B ）。

为确定 CreT 的具体序列，该团队通过截短实验发现 CreT 毒性来自于一段 132bp 的序列（图 2A 中 -54 到 +78 ），其中有一个典型的启动子序列，可起始转录产生了一个 78nt 的小 RNA 。突变分析进一步表明，该启动子及小 RNA 内部一段茎环结构的突变均导致 CreT 毒性的消失（图 2C ），说明 CreT 是一种具有细胞毒性的小 RNA 分子。 CreT 的诱导表达实验进一步证明了其抑菌（ bacteriostatic ）而非杀菌（ bactericidal ）活性（图 2D 和 2E ）。

２、解析了小分子 RNA 毒素 CreT 独特的抑菌机制

对 CreTRNA 的精细序列和结构分析表明，其５ ' 端具有强效的翻译信号 SD （ Shine-Dalgarno ）序列和 AUG 起始密码，紧接其后的是两个精氨酸稀有密码子 AGA, 随后是终止密码子 UGA 和一个茎环结构（图３ A ）。系列突变实验表明，上述关键序列和结构都是 CreT 毒性所必需。基于此，该团队推断了一个全新的分子回路，即 CreT RNA 借助强效的翻译起始信号定位在核糖体上，然后通过两个串联的稀有密码子 AGA 进一步劫持胞内稀有的精氨酸 tRNA ^UCU ，从而抑制了胞内其它重要蛋白的翻译合成和细胞生长。基于这一猜想，他们通过过表达 tRNA ^UCU 成功解除了 CreT 的细胞毒性（图３ B ），证实了这一全新的毒性机制，即 CreT 是通过其 RNA 劫持胞内稀有的精氨酸 tRNA 发挥毒性，而非翻译产生含二精氨酸的小肽发挥作用，因此 CreT 是一类小 RNA 毒素。

３、发现 CreA 抗毒素——类似 crRNA 的小分子 RNA

为揭示 Cascade 蛋白抑制 CreT 毒性的分子机制，该团队首先敲除了胞内唯一的 CRISPR array 结构，从而排除了 CRISPR array 来源的 crRNA 参与毒性抑制的可能性。对 311bp 基因间区的截短与突变实验表明， creT 下游序列为毒性抑制所必需（图２ C ）。精细的序列分析和 Northern 印迹等实验表明， creT 下游有一段与 CRISPRrepeat 高度相似的序列（图 2A ），该序列及其下游序列可独立转录产生一个约 90nt 的前体 RNA ，并被 Cas6 加工为一个的成熟的小 RNA （图４ A ）。该小 RNA 约 41nt ，含有与 crRNA 一样的完整的 5' handle 序列（ 8 nt ），特定的 spacer 序列 ( 约 33nt) ，但缺乏 crRNA 常见的 3' handle ，因此命名为“类 crRNA 抗毒素”（ C rRNA- re sembling A ntitoxin ），简称 CreA 。 CreA 作为 crRNA 类似分子，即可能联合 Cascade 蛋白对 CreT 毒素活性发挥抑制作用。

４、揭示 CreA RNA 联合 Cascade 发挥抗毒素活性的分子机制

该团队进一步揭示，与 crRNA 介导 Cascade 复合物识别外源靶序列一样， CreA 介导 Cascade 精确识别 creT 启动子（图 4B ）。 CreA 种子序列区（ 5' handle 后约 11nt ）与 creT 启动子完全匹配（除不参与碱基匹配的第６个核苷酸外），而其余大部分序列不匹配。对 CreA 的 5' handle 序列和种子序列区的突变、以及对保守 PAM （ protospacer adjacent motif ）序列的突变，都将导致 CreA 对 creT 启动子抑制活性的丧失，进一步证明 CreA 联合 Cascade 实现了对 CreT 的转录水平调控，从而在正常情况下可抑制 CreT 的表达及毒性。

特别需要指出的是，该团队早期实验已经揭示了 crRNA 的高度可塑性，其结构（如是否含有 3' handle 序列）及 spacer 与靶序列匹配长度的不同，可以指导 Cascade 对外源靶标 DNA 实现干扰或引发适应两种不同的生理效应。本研究进一步发现 CreA 与 creT 基因启动子序列之间的不完全匹配性指引了多亚基 Cascade 效应物结合并抑制毒素启动子的活性，从而实现对毒素基因的转录水平调控， 这在国际上首次揭示了多亚基 CRISPR 效应物固有的基因调控生理功能 。

５、揭示 CreTA 对 CRISPR-Cas 系统的护卫功能

通过研究在有无