(1)分析阶段
在circBASE数据库中随机筛选出100个circRNAs,并用qRT-PCR技术通过引物验证出其中在心脏中的环状RNA,并最后在心肌肥大和心衰小鼠模型中验证出mm9-circ-012559(HRCR)的表达水平下降。
(2)初步验证
利用RNAhybird技术发现HRCR与miR223有6个结合位点;
利用biotin-coupled和pull down技术相互验证HRCR与miR223可以相互沉降下来;
(3)进一步验证
利用AGO2 IP技术在miR223转染的细胞中可沉降大量的 circ-HRCR。
FISH探针技术验证circRNA(HRCR)可与miR223在细胞浆中结合。
结论:circRNA(HRCR)可与miR223结合。
(4)更进一步验证阶段
CircRNA(HRCR)与mRNA-ARC的关系:
当HRCR过表达时,ARC的表达水平下降;
当HRCR水平下降时,ARC的表达水平升高;
在心肌细胞中,HRCR过表达时,在ISO诱导下,心肌细胞肥大的情况受到了抑制;而且HRCR的这种抑制作用在ARC缺失的情况下会受到压制。
(5)结论
HRCR可以作为内源性miR223的海绵RNA调节ARC的表达水平和活性。
最后,作者通过在ISO诱导的小鼠中,过表达HRCR,表明HRCR能够抑制心肌细胞肥大和心衰。
以上第三部分可充分证明由标题总结出的第二点,HRCR可以作为内源性miR223的海绵RNA调节ARC的表达水平和活性,从而阻止心肌肥大和心衰。
以上便是逆常规思维分析的circRNA在疾病发生和发展中的作用,本文首尾呼应,首先提出mircroRNA miR223具有导致心肌肥厚和心衰中的功能,在文章的最后又提出circRNA有抑制心肌肥厚和心衰的功能,不愧是15分的大作。
参考文献:Wang K,Long B,Liu F,et al.A circular RNA protects the heart from pathological hypertrophy and heart failure by targeting miR-223.Eur Heart J 2016;37:2602-2611.DOI:10.1093/eurheartj/ehv713