华中农大棉花团队成功地在棉花中建立高效CRISPR-Cas9基因编辑系统

近日，我校棉花研究团队有关 CRISPR/Cas9 技术在异源四倍体棉花中的应用获得重要进展，相关成果在线发表于植物学主流学术期刊 Plant Biotechnology Journal，题目为【High efficient multi-sites genome editing in allotetraploid cotton (Gossypium hirsutum) using CRISPR/Cas9 system】。依赖于团队高效的遗传转化平台，该研究拓展了 CRISPR 技术在多倍体作物中的应用，为棉花功能基因解析提供重要的技术手段。论文共同第一作者为博士生王鹏程和硕士生张军， 张献龙教授和金双侠教授 为论文的共同通讯作者。

自 2013 年在真核生物中成功应用以后，CRISPR/Cas9 系统成为生命科学研究的关注热点，成为近年来最受欢迎的基因组编辑系统。该系统具有稳定性强、效率高和操作简单的特点。利用 CRISPR/Cas9 技术能够成功实现基因组水平的基因敲除，基因转录调控和修饰。目前该技术广泛应用于动物细胞，植物中在水稻、拟南芥、玉米等模式作物中应用较多，而在多倍体植物，如棉花，油菜中的应用较少。原因在于目前生产上种植的棉花是异源四倍体，有 52 条染色体，基因组庞大、复杂（2.5 Gb，相当于拟南芥基因组大小的 20 倍，水稻基因组的 6 倍），同源重复序列多（70% 左右），同一基因也具有多个拷贝，目前很难获得有效的单基因突变体。目前在棉花中常规的基因功能研究手段是 RNAi 技术，该技术往往造成同源基因（基因家族）的沉默表达而产生非预期的表型，同时 RNAi 技术往往对靶标基因沉默不彻底，后代中也出现沉默效应不稳定，甚至消失的情况，因此在棉花中开发新型的功能基因组研究手段，势在必行。

图片说明 ：CRISPR-Cas9 系统成功敲除棉花基因组中的外源 dsRFP 基因

华中农大棉花团队至从 2013 年开始，就在棉花中开始了基因编辑的研究工作，包括构建了适用于棉花遗传转化体系的 TALEN 载体及三套 CRISPR-Cas9 系统。在本研究使用的载体是本实验室运用的第三套 CRISPR-Cas9 系统，该系统针对水稻中已有的 CRISPR/Cas9 表达载体进行了改造，使用了棉花內源的 U6 启动子和合适的抗生素筛选标记。利用一个已经获得外源报告基因 DsRed2（红色荧光蛋白基因）的材料为受体进行二次转化，实现了两个靶标位点的同时敲除，再生植株的红色荧光完全消失。另外，以内源的棉花叶绿素合成相关基因 GhCLA1 为靶标设计的三对 sgRNA 也成功实现基因敲除，各靶标位点的编辑效率达到 66.7%~100%，再生植株产生显著的白化苗表型。对 T0 代植株及其后代的的遗传分析表明，目标基因可以被突变但没有脱靶效应，而且这种突变能够稳定遗传到后代。本研究创新之处在于充分结合第二代高通量测序技术，实现对大量再生植株突变位点的快速鉴定，大大提高转基因植株突变鉴定的效率，为实现 CRISPR/Cas9 系统创造棉花基因突变体库及功能基因组研究打下坚实基础。目前这一高效的棉花基因编辑载体已经通过合作研究的形式发放给包括澳大利亚联邦科学与工业研究组织（CSIRO）、浙江大学、南京农大、华中科大、华中师范大学、西南农大、山东农大、石河子大学、中棉所等国内外 10 多家国内外科研机构的同行，共同推动棉花的基因组编辑工作。

本研究获得十三五国家重点研发专项和转基因专项基金的大力支持。

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