血管生成是成人骨骼发育、重塑和修复过程中骨形成的重要初始步骤。这导致组织高度血管化，其中内皮细胞和骨骼细胞不断处于串扰状态以促进体内平衡，这一过程由许多环境信号介导，包括机械负荷。这种通讯的中断会导致疾病和/或骨折修复不良。
间充质干细胞/基质细胞（MSC）分泌蛋白组的促血管生成作用已得到充分证实，并且是许多利用这种细胞类型进行组织修复的细胞疗法的驱动力。有趣的是，
MSC 分泌蛋白组的促血管生成特性在机械负荷后增强。成骨细胞和骨细胞也被证明可以调节血管生成，表明成骨谱系的细胞可以协调血管形成。
此外，虽然成骨细胞的机械激活进一步增强了分泌蛋白组的血管生成特性，但目前尚不清楚骨细胞是否也具有相同的机械驱动反应。
细胞外囊泡（EVs）是一组高度异质性的细胞衍生脂质结构，参与多种生理和病理过程，已成为许多组织（包括骨组织）中细胞间通讯的有效介质。
骨细胞已被证明可以释放促成骨 EV，这些 EV 的再生效力取决于亲本细胞的机械激活。
然而，成骨细胞和骨细胞衍生的 EVs 的血管生成特性仍然未知。因此，EVs 代表了成熟骨细胞介导血管生成的潜在机制。
基于此，
爱尔兰都柏林圣三一生物医学科学研究所
团队进行了深入研究，
首先确定成熟骨骼细胞（成骨细胞和骨细胞）是否可以调节内皮细胞增殖、迁移和血管生成，以及这个过程是否受到机械调节；其次，研究这种潜在的促血管生成旁分泌信号是否可以通过细胞外囊泡的分泌来介导；最后，探索 EVs 可能通过包裹和递送促血管生成介质介导血管生成反应的潜在机制。
这项研究代表对骨骼中成骨和血管生成的复杂耦合的进一步见解，并表明骨源性 EVs 作为新型血管生成疗法的潜力。研究成果发表于
Journal of Tissue Engineering
期刊题为
“Mechanically activated mesenchymal-derived bone cells drive vessel formation via an extracellular vesicle mediated mechanism”
。
为了确定成熟骨骼细胞是否可以协调血管生成，首先对骨样细胞 MLO-Y4 与成骨样细胞 MC3T3 细胞系施加机械剪切刺激（0-3.2 dyne/cm2），检查了响应从静态培养和机械活化成骨细胞和骨细胞收集的条件培养基中的 HUVEC 增殖和募集，发现内皮细胞的增殖不受从静态培养的成骨细胞或骨细胞（S-CM）收集的条件培养基的影响，然而，
在机械刺激成熟骨骼细胞后，与没有 VEGF 培养基的对照组相比，用来自成骨细胞和骨细胞的机械激活条件培养基（MA-CM）处理时内皮细胞增殖显著增加。
内皮细胞的募集同样受到成骨细胞和骨细胞的影响。静态培养的成骨细胞和骨细胞的条件培养基引起内皮细胞迁移的小幅度增加，然而，
在成骨细胞和骨细胞的机械激活后，与没有 VEGF 培养基的对照组相比，内皮细胞募集显著增加。
虽然 MA-CM 对内皮增殖的影响与 VEGF 相似，但在募集方面，VEGF 在两种类型的成熟骨骼细胞中均显著优于 CM。（VEGF 是一种促血管生成因子，在所有测定中均用作阳性对照。）
这些数据表明，经受机械刺激的成熟骨骼细胞释放的旁分泌因子可以增强内皮细胞的增殖和募集，为早期血管生成做准备。
随后，检查了从静态培养和机械激活的成骨细胞和骨细胞收集的条件培养基对 HUVEC 管形成的反应（图1）。与无 VEGF 对照相比，用 10 ng/mL VEGF 处理 18 小时后，明显可见清晰的小管样形成（图1 a）。图像定量后发现，
VEGF 处理显著增强了分支的形成、管长和连接密度，证明这种细胞类型如前所述具有血管生成的能力
（图1 b、c）。
用从静态培养的成骨细胞和骨细胞中收集的 CM 以 1：1 的比例补充 HUVEC 培养基以分析管形成。在静态培养的成骨细胞和骨细胞的补充组中，18 小时后没有明显的血管生成证据（图1 a、b、c）。有趣的是，
在补充机械激活的成骨细胞和骨细胞 CM 后，两组的管形成都很明显，且与补充 VEGF 时情况相同
（图1 a）。此外，图像量化显示，与无 VEGF 阴性对照和静态培养的骨骼细胞 CM 相比，用机械激活的成熟骨骼细胞 CM 处理导致分支数量、管长和连接密度在统计学上显著增加（图1 b、c）。
这些数据表明，成熟骨骼细胞通过机械刺激后的旁分泌机制驱动血管生成。
图1 机械激活的成骨细胞和骨细胞通过旁分泌机制诱导 HUVEC 中的血管形成。
接下来，研究了 EVs 是否可能在机械刺激后成熟骨骼细胞血管生成的调节中发挥作用。使用超速离心法从成骨细胞和骨细胞的 CM 中收集 EVs 并对其进行表征，
数据表明骨样细胞 MLO-Y4 与成骨样细胞 MC3T3 细胞系分泌的细胞外囊泡大小、数量和表面标记物表达相似。
为了评估机械激活的骨细胞衍生的 EVs（MA-EVs）对血管生成的潜在影响，用从机械激活的成骨细胞和骨细胞 CM 中分离的 EVs 处理 HUVECs。此外，还用耗尽 EVs 的 MA-CM 处理 HUVECs，以确定培养基内的可溶性因子是否可能引起血管生成反应。有趣的是，
先前增强内皮细胞增殖的成骨细胞和骨细胞 MA-CM 在培养基中耗尽细胞外囊泡后没有引起任何显著反应。然而，利用从机械激活的成骨细胞和骨细胞-CM 中分离的 EVs，可以看到内皮增殖显著增加。
在内皮细胞的募集方面，与无 VEGF 对照相比，成骨细胞和骨细胞中耗尽 EVs 的 MA-CM 引起内皮细胞迁移的小幅度增加，而从成骨细胞 MA-CM 中分离的 EV 诱导了迁移更强烈的增加。
然而，与耗尽 EV 的 MA-CM 或 VEGF 对照相比，从骨细胞 MA-CM 中分离的 EVs 不会进一步影响内皮细胞募集。这些数据表明，经受机械刺激的成熟骨骼细胞释放的细胞外囊泡可以增强增殖，并在一定程度上增强内皮细胞的募集，为早期血管生成做准备。
进一步检测了响应机械活化成骨细胞和骨细胞分泌的 EVs 的 HUVEC 管形成（图2 a）。先前增强血管生成的成骨细胞和骨细胞 MA-CM 在培养基中耗尽细胞外囊泡后没有引起任何显著反应（图2 a、b、c）。
然而，在补充从成骨细胞和骨细胞 CM 中分离的机械激活的 EVs 后，两组的管形成都很明显，且与 VEGF 阳性对照中观察到的情况相同
（图2 a）。此外，图像的量化显示，与无 VEGF 阴性对照和机械激活的 EVs 耗尽的骨骼细胞 CM 相比，用机械激活的 EVs 处理导致的分支数量、管长和连接密度在统计学上显著增加（图2 b、c），但骨细胞衍生的 MA-EVs 处理后的连接密度除外。
这些数据表明，成熟骨骼细胞通过机械刺激后的 EV 释放机制驱动血管生成。
图2 机械激活的成骨细胞和骨细胞释放的细胞外囊泡诱导 HUVEC 中的血管形成。
最后，为了研究成骨细胞和骨细胞释放的 VEGF 是否可能有助于上述研究的结果，分析了从静态培养和机械激活的成骨细胞和骨细胞中分离的 CM 中的 VEGF 水平，以及来自耗尽 EVs 和分泌 EVs 细胞的 MA-CM。
令人惊讶的是，从静态培养或机械激活的成骨细胞收集的 CM 中的 VEGF 水平几乎检测不到（图3 a）。虽然机械刺激确实使成骨细胞分泌组中 VEGF 的浓度提高了 ~1.5 倍，但这并不显著。同样，成骨细胞来源的 MA-EVs 和耗尽 EV 的成骨细胞 MA-CM 也含有可忽略不计的 VEGF 量。
相比之下，骨细胞分泌更高浓度的 VEGF （图3 c），机械刺激更将其提高了 1.8 倍。
有趣的是，在骨细胞来源的 MA-EV 中几乎没有检测到 VEGF，
所有 VEGF 都在耗尽 EVs 的 MA-CM 中检测到，这表明 VEGF 在细胞释放之前没有特异性包裹在 EVs 中。这些数据表明，成熟的骨骼细胞，特别是骨细胞，分泌促血管生成因子 VEGF，并且这种分泌受到机械调节，但不包裹在细胞外囊泡内。
由于细胞外囊泡已被证明可以通过 miRNA 的包裹和递送来介导通讯，其中许多是已知的血管生成的调节因子，因此研究了 MA-EVs 中的 miRNA 载物。使用高通量测序（miRNA-seq）对静态培养和机械刺激的骨细胞释放的细胞外囊泡内的 miRNA 进行分析，其中122 个 miRNA 显示出强表达信号。功能过表达分析（ORA）发现，与基因本体类别相关的 miRNA 显著富集，如血管重塑、细胞增殖和血管生成的正调控。
差异表达分析揭示了两种不同的 miRNA，与来自静态培养的骨细胞条件培养基的 EV 相比，它们在 MA-EV 中显著上调（mmu-miR-150-5p 和 mmu-miR-2137）。这些数据表明，骨细胞释放含有与血管生成相关的 miRNAs 的细胞外囊泡，这些 miRNAs 在机械刺激下增加。
图3 成骨细胞和骨细胞分泌低水平的 VEGF，该 VEGF 是机械调节的，独立于细胞外囊泡。
总之，该研究展示了一种新的机制，即机械负荷通过从成熟骨骼细胞（如成骨细胞和骨细胞）释放细胞外囊泡来调节血管形成。这为研究机械激活的骨骼细胞衍生的细胞外囊泡作为一种促进血管生成和组织再生的新型疗法开辟了一条新途径。因此，骨细胞 MA-EV 可能代表一种多靶点疗法，可通过全身或局部递送进行组织修复。
