有机残留物分析综述 part 3/6

你好，这是本兔的第 80 篇推送。

一个人摸爬滚打了两年多，本兔也 终于约到别人的稿件了！

本文来自我优秀的师弟 宋殷 同学，原文上下篇发表于 《古代文明研究通讯》 2015年64期和66期 。 有幸拜读过，洋洋洒洒四万字，阐述了残留物分析的发展历程和技术细节的方方面面，旁征博引，极尽详细。

本公众号得到作者授权转载，希望有更多的朋友能看到并与我们讨论。

由于原文较长，特拆分为六篇连载推送。 现在您看到的是第三篇，包含原文的第三章第二-四节。

三、陶器上的殘留物（续）

3.2 脂類降解

有機殘留物分析主要是用溶劑提取表面可見的沉積物和吸附於陶器的內壁結構上。以往的有機殘留物分析主要依賴於對穩定的脂類（如橄欖油、甘油三酯、蜂蠟、植物葉蠟等）的鑒別並對應到產生這些脂類的植物或動物上。而甘油三酯可水解釋放出自由脂肪酸（free fatty acids） [66] 如圖四所示：

圖四 甘油三酯水解方程式

除水解以外，在加熱的條件下，如圖五所示脂肪酸之間可以發生脫羧反應生成酮類化合物 [67] 。

圖五 脂肪酸脫羧反應[67]

而多不飽和脂肪酸生成如圖六所示合環並且芳香化 [67] 。

圖六 多不飽和脂肪酸合環芳香化[67]

不飽和脂肪酸在接觸氧氣等氧化物的時候會發生氧化反應生成多種氧化產物 [68] 。由於這些氧化產物相比原始的脂肪酸更容易溶於水而從陶片中流失，故而這些化合物很少能被檢測出來。馬汀•裡戈尓特（Martine Regert）等人 [69] 為了檢測出脂肪酸的氧化產物通過用氫氧化鈉（NaOH）對保水埋藏條件下的陶片上的不溶沉積物進行皂化反應（Saponification Reaction），對提取產物和用氣相色譜/質譜方法進行檢測（圖六），發現了不飽和脂肪酸的氧化產物（圖七）。由於這些氧化產物是以共價鍵形式連接在陶片上的炭化沉積物上，故不會被水溶失，而在乾旱的埋藏條件下如埃及的Qasr Ibrîm遺址，遊離的氧化產物可以被檢測出來。由此可以推斷常規液相提取方法中沒有發現的遊離不飽和脂肪酸氧化產物被水溶失。

圖七 皂化反應後脂肪酸氧化產物的氣相色譜圖，空心對應雙酸，實心對應羥基酸[70]

圖八 不飽和脂肪酸氧化產物分子結構式[70]

3.3 吸附機理

大部分脂類化合物由於其不易溶於水的特性而成為所有生物分子殘留物中被研究最頻繁的一類化合物。在一些早期的研究中，直接對植物進行提取得到的脂類化合物種類和相對含量和考古樣本或實驗考古樣本中的脂類相互接近，故而人們可以直接將考古樣本中的殘留物組成和從特定種類的植物中提取到的殘留物組成進行對應，從而推斷出殘留物來源 [71] ， [72] 。然而，在對於殘留物的吸附過程和吸附機理這方面的研究仍然很缺少，在此僅舉一例 [73] 進行分析。

首先，拉瑞莎•哥登堡（Larisa Goldenberg）等人總結了以往的有機殘留物分析中的問題，即學界大多通過提取不可見的遊離有機分子來推斷其來源，對不溶性的沉積物研究較少，而且萃取過程局限於使用氯仿/甲醇混合溶液，用皂化反應（Saponification Reaction） [74] 可以提取到更多有機脂肪酸。

其次，拉瑞莎•哥登堡（Larisa Goldenberg）等人介紹了他們發明的用於檢測陶片吸附脂肪酸含量的新方法，即先利用碘蒸氣和吸附在陶片上的不飽和脂肪酸進行反應，在真空泵抽去未被吸附的碘蒸氣後再用X射線熒光光譜儀（XRF）檢測被吸附的碘濃度（即相對於陶片樣品質量的百分比）。

在實驗部分，拉瑞莎•哥登堡（Larisa Goldenberg）等人通過實驗考古的方式複製了一個“標準陶器”作為參考，同時用發掘於Tel es-Safi和Ramat Rahel兩個遺址的陶片作為研究對象，並對所有樣品進行如上所述的XRF分析，之後樣品經過製備用於掃描電子顯微鏡（SEM）和X-射線能譜儀（EDS）進行元素分析。除了部分樣品使用傳統的氯仿/甲醇混合溶劑萃取外，部分樣品通過酸萃取方法來提取有機物。

實驗結果如下：樣品和碘蒸氣反應後利用X射線熒光光譜儀（XRF）檢測樣品中碘濃度。如圖九所示對照樣品約0.06%，Tel es-Safi的樣品碘含量除了兩個樣品分別為0.07%和0.08%以外均低於0.06%這一本底值，而Ramat Rahel遺址的樣品除一個以外有九個高於平均碘含量值，且經過氯仿/甲醇萃取後有機物含量為130 μg/g。而這一結果也與作者提到的Tel es-Safi遺址有機物保存環境不好而Ramat Rahel的保存環境良好相對應。

圖九 不同樣品含碘量百分比（最左側為對照組，中間為Tel es-Safi的樣品，最右為RamatRahel遺址的樣品）

對於和碘反應後的樣品分別進行氯仿/甲醇混合溶液萃取和酸萃取，發現酸萃取的效率 明顯要比有機混合溶劑的萃取效率高（圖十）。

圖十 Ramat Rahel遺址樣品的有機混合溶劑萃取和酸萃取萃取效率

作者繼續對對照樣和兩個遺址的樣品做了背散射電子像（BSE image）和二次電子像（Secondary electron image）掃描分析，發現可被觀察到的碘元素的分佈基本與鈣元素分佈重合而與矽元素的分佈不重合（由於清晰度所限，分佈圖將不在此羅列，有興趣的讀者可參考原始文獻），作者於是得出了油酸分子優先吸附於含鈣礦物的表面而很少吸附於含矽類礦物的表面。

作者接下來討論了利用X射線熒光光譜儀（XRF）進行預先篩選（pre-screen）的不足之處，即對照樣品碘含量過高且尚不清楚原因何在，其次油酸遠沒有硬脂酸穩定可能會發生雙鍵的氧化反應從而使得油酸含量被低估。作者通過對吸附油酸分子的的礦物研究對吸附機理進行了探討，即油酸通過酸-堿作用結合在鈣離子表面，同時粘土表面的氫氧根離子（OH ^- ）和油酸也可以通過氫鍵的作用結合。

然而這篇文章中需要注意的地方其一是模擬陶器表面上的高本底值（碘的質量百分比），作者推測為其它不溶性沉積物中的有機質和碘發生了反應，但這一過程是僅發生於模擬陶器樣本還是同時發生於考古樣本作者沒有進行深入研究；其二，由於碘本身也可以被吸附於陶器表面，如何通過引入其它標記法對僅從“碘吸附”實驗上得出的結論進行驗證也是一個需要解決的問題；其三，用酸來提取有機殘留物的原理尚不清楚，是否存在氫離子和鈣離子之間對脂肪酸的競爭反應，這一萃取有機殘留物的方法是否可以取代傳統的氯仿/甲醇混合溶劑萃取也是需要探討的問題。

3.4 脂肪酸比值法和穩定同位素法

脂肪酸比值法即通過比較不同種類脂肪酸之間的比值從而確定該類脂肪酸來源地生物物種。這其中最經典的例子 [75] 即通過C16:0和C18:0之間的比值的不同得到其來源於植物油或動物脂肪，如圖十一所示，左側譜圖對應植物油，右側譜圖對應動物脂肪。

圖十一 新石器時代晚期土耳其的Ҫayönü和約旦的al-Basatîn的陶片萃取物的色譜圖[75]

加拿大學者馬萊妮（M.E. Malainey）等人在對加拿大西部可能被古人作為食物所利用的動植物進行脂肪酸分析並利用等級聚類法（Hierarchical cluster）和主成分分析法（principal component analyses）對脂肪酸分析結果進行處理。分析結果顯示大型哺乳動物脂肪、大型食草動物肉類、魚類、植物葉片、植物根類、植物種子或果實之間可以區分開來，而小型哺乳動物脂肪酸組成更接近於它們所食用的植物種子果實類。同時，研究者們還發現大型哺乳動物和魚類含有較高水準的C16:0和C18:1，而野牛肉和鹿肉含有較高水準的C18:0，魚類含有較高水準的VLCP（Very Long Chain Polyunsaturated Fatty Acids，非常長鏈（C20，C22，C24）的多不飽和脂肪酸）。研究者們同時發現植物的種子或果實或堅果和植物綠葉或植物根類可以通過C18:2和C18:3 ω3含量的不同來區分 [76] 。

在馬萊妮（M.E. Malainey）等人的另外一項工作中，研究者們分析了來自18個地點的超過200件陶片樣品並採用之前研究76中同樣的分析方法進行分析。分析結果顯示來自草地平原和草原-派克蘭（grassland-parkland）過渡地帶的樣品主要用於烹飪大型食草動物和植物以及二者之間的混合，而樣品顯示為烹飪過魚類和植物以及二者混合出土于派克蘭（parkland）和北方森林（boreal forest）的南部地區。而這一分析結果也與在這些區域所發現的動物群遺存以及捕獵工具相對應 [77] 。

然而，這樣的研究也有存在一些問題。虽然研究者们在另一篇文献中讨论了氧化和加热导致脂肪酸降解的影响 [78] 但他們沒有考慮埋藏過程中可能會出現的如微生物降解作用、地下水溶失短鏈脂肪酸以及脂肪酸的氧化降解過程導致的含量變化。針對這些問題，厄爾肯斯（J.W. Eerkens）使用了脂肪酸比值法來研究陶器上殘留物的可能來源 [79] 。首先，厄爾肯斯發現了綠葉類較果實或種子類含有更高的C16:1/C18:1比值。植物根類相較肉和植物果實類含有更高的(C15:0+C17:0)/C18:0比值。而以C16:0/C18:0對C12:0/C14:0作圖可以更好的區分出魚類和肉類。厄爾肯斯在選取位于比值分子和分母位置的脂肪酸分子時選取了降解速率接近的兩種脂肪酸，從而使得雖然存在降解過程但對這一脂肪酸比值影響不大。但值得提出的是，這其中C16:1/C18:1比值在大多數食物種類中會隨著時間升高到5左右，這一過程有可能和優先降解C18:1有關。通過和已建立的資料庫中材料的脂肪酸比值圖相對應我們可以看到大部分的實驗樣品點落在了植物根類和種子類分佈範疇內（如圖十二和圖十三所示），作者由此推斷大部分樣品用於烹煮種子類食物。

圖十二 考古陶片以(C15:0+C17:0)/C18:0對C16:1/C18:1所作分佈圖[80]

圖十三 考古陶片以C12:0/C14:0對C16:0/C18:0所作分佈圖[81]

同時，作者將烹煮植物種子的陶片和可能烹煮肉食的陶片對比發現前者大多口直且外侈而且器壁較薄，可能是為了便於迅速升到高溫將種子煮熟使得其更易於消化，而烹煮肉食的陶器器壁較厚且斂口，可能是為了方便長時間燉煮。作者以此看出了製造陶器時工程學的考量和陶器的使用用途結合很密切，說明古人在製作陶器時對陶器的功能是有意識的 [81] 。

從以上所述幾項研究可以看出：脂肪酸比值法是一種相對可靠的追溯脂肪酸生物來源的方法，但是在獲得結果之前需要大量的資料庫的數據積累。其二，由於脂肪酸的降解、氧化等作用導致的數據點的“漂移”也是需要考慮的因素。其三，所檢測的陶片上需要有足夠量的脂肪酸可以被提取出來用於計算脂肪酸比值，而且陶片應該原始埋藏於相對乾燥的環境中以減少地下水溶失短鏈脂肪酸以及微生物活動的影響。

穩定同位素方法是利用有機分子中的穩定同位素如 ¹³ C, ¹⁵ N, ¹⁸ O, ² H等元素在化合物中所含比例不同而區分有機分子的不同生物來源的一種分析方法，其中 ¹³ C 和 ¹⁵ N 主要涉及物種間或物種不同部位間不同生理代謝途徑的差別，而 ¹⁸ O, ² H 主要涉及分子來源地的資訊。模特拉姆（H. R. Mottram）等人的一項早期工作 [82] 顯示可以利用如飽和脂肪酸組成、雙鍵的位置、甘油三酯的分佈以及δ ¹³ C 等資訊來區分脂肪酸的生物來源，即來源於山羊/綿羊、牛或豬。

然而，利用脂肪酸比例來區分牛奶被認為是不可行的，其原因為牛奶中含有大量短鏈脂肪酸（C4:0到C12:0），而這些短鏈脂肪酸很容易從甘油三酯上水解下來並由於其較高的水溶性而被地下水所溶失，所以很難從考古樣品中檢測出這類脂肪酸 [83] 。一個新的方法 [84] （機理如圖十四所示）是基於食物中碳和脂肪酸在反芻動物體內合成乳脂肪和體脂肪的代謝途徑不同而區分乳製品和肉類製品的方法。由於反芻動物的乳脂肪主要由食物中的不飽和脂肪酸轉化而來，體脂肪則包含大量從糖類轉化而來的脂肪酸，故乳脂肪中的脂肪酸主要反映了食物中不飽和脂肪酸的組成。

圖十四 碳穩定同位素方法區分體脂肪和乳脂肪原理示意圖[82]

科普利（M.S. Copley）等人 [85] 分析了來自14個考古遺址，年代跨度為從早期新石器時期到晚期鐵器時期的950個出土時存在著良好層位關係的陶片上的兩種飽和脂肪酸C16:0和C18:0的δ ¹³ C 以確定古人是否曾經食用乳製品。現代的參照樣本分析結果如圖十五所示，考古樣本分析結果如圖十六所示。實驗結果顯示這14個採樣遺址都存在著利用牛乳的情況。科普利（M. S. Copley）等人認為這項研究和當時流行的假說即利用動物的乳製品和農業傳入英格蘭大約同時在西元前五千紀末期。

圖十五 現代樣品C16:0和C18:0的δ13C值分佈圖[85]

圖十六 考古樣品C16:0和C18:0的δ13C值分佈圖[85]

在此之後，科普利（M. S. Copley）等人及其他學者延續著這一研究方法進行人類利用乳製品的研究。科普利（M. S. Copley）等人研究了英國鐵器時期 [86] 、青銅時期 [87] 和新石器時期 [88] 共十四個考古遺址，均發現了人類利用乳製品的跡象，同時對比可能承裝牛奶的陶器和用於烹煮肉製品的陶器的口徑，發現前者口徑小於後者 [86] ， [87] 。朱利•頓恩（Julie Dunne）等人研究了綠色撒哈拉非洲地區的陶器上的殘留物，發現了當地在西元前五千紀即存在人類利用牛奶的證據 [89] 。斯龐柏格（J. E. Spangenberg）等人通過實驗獲得了新石器時代晚期（3384-3370 BC）在瑞士的Arbon Bleiche 3地點存在人類利用乳製品的證據，並進一步提出當時的人們可能利用發酵手段延長乳製品壽命的假說 [90] 。薩爾庫（M. Salque）等人 [91] 研究了一種特殊陶器的殘留物發現其可能和製作乳酪有關，很可能是為了適應當地不耐受乳糖的史前農業群體而製作的低乳糖乳酪。

雖然穩定同位素方法在確認乳製品使用方面有著廣泛的應用，一些研究者還是對這一方法的可靠性提出了質疑。邁克爾•格裡格（Michael W. Gregg） [92] 首先在分析已有的相關文獻基礎上提出不同地區的反芻動物食用不同光合路徑的食物（即C3和C4類植物），從而使得科普利（M. S. Copley）等人 [93] 在歐洲的工作中得到的資料（食草動物大部分以C3類植物為食）不能輕易用於中東地區人類利用乳製品的確認（如圖十七所示）。

圖十七 中東地區十七個陶片中提取殘留脂肪酸C16:0和C18:0的 δ ¹³ C 值分佈[92]

其次，斯龐柏格（J. E. Spangenberg）等人 [94] 發現不同動物體內合成C16:0和C18:0時碳同位素的分餾存在較大差異，即發現不同地區的現代的豬、羊脂肪，牛乳和山羊乳酪樣品的C16:0和C18:0的碳同位素比值亦無法分佈於埃佛謝德（R. P.  Evershed）小組在歐洲的工作中確定的現代反芻和非反芻動物脂肪以及反芻動物乳脂肪的分佈範圍內（如圖十八所示）。

圖十八 中歐、中東、中亞地區現代參照樣本的脂肪酸C16:0和C18:0的 δ ¹³ C 值分佈[95]

斯龐柏格（J. E. Spangenberg）等人同時提出了除生理因素導致碳同位素分餾以外的其它可能，包括牛奶中C16:0和C18:0的δ ¹³ C升高可能來源於生產過程中的高溫導致較輕的碳優先被降解釋放。

邁克爾•格裡格（Michael W. Gregg）根據中東地區最早發現的陶器均分佈在已掌握動物馴化的人群中，故而想通過殘留物分析檢測這些早期陶器是否能反映史前人類利用乳製品。然而由於上文提到的種種原因使得得到的結果無法確實反映乳製品的存在，大部分數據和反芻動物體脂肪以及非反芻動物體脂肪資料分佈區域相重疊（如圖十九所示）。

圖十九 中東地區新石器時期居址的25個陶片樣品中提取的脂肪酸C16:0和C18:0的 δ ¹³ C 值基於中北歐、中東和中亞地區現代參照樣本豬、反芻動物和反芻動物乳脂肪酸的 δ ¹³ C 值的分佈（資料點和誤差線為每個樣本三次測量結果的反映）[96]

鑒於基於中北歐、中東、中亞的現代參照樣本的C16:0和C18:0的 δ ¹³ C 值的範圍重疊，作者建議科技考古學家對脂肪酸C16:0和C18:0的 δ ¹³ C 分析溯源的結果保持慎重態度 [96] 。

参考文献

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[67] Evershed, R. P., 2008, Organic residue analysis in archaeology: the archaeological biomarker revolution, Archaeometry , 50(6), 895-924.

[68] Evershed, R. P., 2008, Organic residue analysis in archaeology: the archaeological biomarker revolution, Archaeometry , 50(6), 895-924.

[69] Regert, M., Bland, H. A., Dudd, S. N., Bergen, P. F., Evershed, R. P.,1998, Free and bound fatty acid oxidation products in archaeological ceramic vessel, Proceedings of the Royal Society of London B , 265, 2027-2032.

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[71] Evershed, R. P., Heron, C., Goad, L. J., 1991, Epicuticular wax components preserved in potsherds as chemical indicators of leafy vegetables in ancient diets, Antiquity , 65, 540-544.

[72] Charters, S., Evershed, R. P., Quye, A., Blinkhorn, P. W., Reeves, V., 1997, Simulation experiments for determining the use of ancient pottery vessels: the behavior of epicuticular leaf wax during boiling of a leafy vegetable, Journal of Archaeological Science , 24, 1-7.