昆植所黄胜雄组Nat Plants｜药用黄芪三萜皂苷的完整的生物合成

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该团队构建了膜荚黄芪的染色体水平基因组。膜荚黄芪基因组有 9 条染色体，组装大小为 1.44 Gb ， contig N50 2.82 Mb ， BUSCO 完整度为 92.44% 。除此之外， 2023 年中国农业大学董学会教授和孙连军教授（ Plant Communications ， 2022 ， 4 ， 100469 ）通过测定蒙古黄芪（膜荚黄芪的变种）基因组推测蒙古黄芪 7 号染色体上可能存在黄芪三萜合成的基因簇（ BGC ），包括一个环阿屯醇合成酶，一个细胞色素氧化酶（ cytochromeP450 ， CYP450 ）和一个尿苷二磷酸糖基转移酶（ uridine diphosphate glycos-yltransferase ， UGT ）。同样，黄胜雄团队通过分析膜荚黄芪基因组，发现环阿屯醇合成酶（ AmOSC3 ）附近也存在一个 CYP450 和一个 UGT ，但是通过异源体内体外功能验证，发现基因组上 AmOSC3 附近的 CYP450 和 UGT 不参与 AG IV 的生物合成。因此初步认为负责 AG IV 生物合成的基因在膜荚黄芪中不以簇的形式呈现。进一步对膜荚黄芪不同组织的转录组数据结合系统发育树分析，挖掘到催化环阿屯醇 C-16 羟化的氧化酶（ AmCYP88D25 ）和 C-3-OH 糖基化的糖基转移酶（ AmGT11 和 AmGT72 ）（ 图2 ）。并通过基因的组织特异性表达和酶动力学初步推测 AmGT11 更有可能参与 AG IV 的生物合成。

通过分析膜荚黄芪的基因组，该团队发现 AmCYP88D25 和 AmGT11 都位于 1 号染色体上，且这个区域（约 4Mb ）的范围内包含另外 2 个 CYP450s （ AmCYP88D7 和 AmCYP71D756 ）和两个糖基转移酶（ AmGT36 和 AmGT37 ）（ 图3 ）。这个潜在的 BGC 在蒙古黄芪中也存在，更加印证这些基因可能参与黄芪属植物 AG IV 的生物合成。通过体外酶促反应证实 AmGT36 负责 C-6-OH 的葡萄糖糖基化（ 图2 ）。异源体内证实导入 AmCYP88D25 和 AmCYP88D7 的酵母菌株生产化合物 6 ， 16-dihydroxycycloartenol ，从而说明 AmCYP88D7 负责 AG IV 生物合成过程中的 C-16 羟化（ 图 3 和图 4 ）。同样，导入 AmCYP88D25 和 AmCYP71D756 的酵母菌株经验证生产1 6 ， 24 ， 25-trihydroxycycloartenol ，由于酵母中存在环氧水解酶，因此猜测 AmCYP71D756 可能是催化1 6-hydroxycycloartenol 的 C-24 ， 25 环氧化（ 图 3 和图 4 ）。通过 AmCYP71D756 的酵母微粒体体外实验证实这一猜想。但是同时导入 AmCYP88D25 、 AmCYP88D7 和 AmCYP71D756 的酵母菌株的发酵产物中虽然化合物1 6 ， 16-dihydroxycycloartenol 和1 6 ， 24 ， 25-trihydroxylation 的峰面积降低，但是没有新的化合物出现，猜测可能是酵母内源的酶可能催化相应的产物，从而没有检测到新的化合物峰。因此，该团队进一步在烟草中验证这 3 个基因的功能，经过检测发现导入这 3 个 CYP450s 后，烟草中产生了化合物 cyclocantogenin ，— 24 ， 25-epoxy-6 ， 16-dihydroxycycloartenol 的水解产物。为了进一步证实 AmCYP88D7 和 AmCYP71D756 的活性，该团队通过体外酵母微粒体实验，分别以 24 ， 25-epoxy-16-hydroxycycloartenol 和 6 ， 16-dihydroxycycloartenol 为底物，经过检测证实 AmCYP88D7 和 AmCYP71D756 都能催化 24 ， 25-epoxy-6 ， 16-dihydroxycycloartenol 的产生。这些结果表明， AmCYP88D7 和 AmCYP71D756 发挥协同作用，将化合物 16-hydroxycycloartenol 氧化为 24 ， 25-epoxy-6 ， 16-dihydroxycycloartenol （ 图 3 和图 4 ）。

虽然通过体内体外功能验证了这个 BGC 上 5 个基因的功能，但是仍未完整解析 AG IV 的生物合成通路。该团队继续分析这个 BGC 中的其他类型的基因，发现该 BGC 中存在另外一类氧化酶— α - 酮戊二酸依赖的双加氧酶（ OGD ）。对 AmOGD1 体外功能验证，证实其负责催化 AG IV 生物合成过程中 20 ， 24- 四氢呋喃（ THF ）环的形成（ 图 3 和图 4 ）。随后，该团队选择了原人参三醇作为模型，推测 AmOGD1 可能催化 24 ， 25-epoxy-6 ， 16-dihydroxycycloartenol 的 C-20 的羟化，从而形成黄芪皂苷中的 20 ， 24-THF 环。除此之外，该研究团队通过 RNA 干扰（ RNA interference ， RNAi ）技术进一步在黄芪毛状根中证实了这 6 个基因参与膜荚黄芪中 AG IV 的生物合成。该团队还在烟草中进一步验证 AmGT11 和 AmGT36 的催化先后顺序，但是根据实验结果证实 AmGT11 和 AmGT36 存在底物宽泛性（ 图 4 ），没有严格的底物特异性。该团队在挖掘到完整负责 AG IV 生物合成的基因后（ 图 4 ），将其通路重构在烟草中。正如预期的那样，在烟草中表达 AmOSC3 、 AtCPR1 以及本研究中鉴定的 6 个修饰酶，最终该团队在烟草叶片中检测到了 AG IV 的产生（产量为 0.293 mg/g ；干重），并通过过表达上游三萜前体合成通路基因 NbtHMGR 成功地将烟草叶片中 AG IV 的产量提高至 2.224 mg/g （干重。）

黄胜雄课题组通过对膜荚黄芪基因组和转录组进行分析，挖掘出膜荚黄芪中 AG IV 生物合成的 BGC （ 图 3 和图 4 ），并通过在烟草叶片中瞬时表达，实现了 AG IV 的异源合成 。 该研究发现的黄芪三萜生物合成基因簇是目前自然界报道的最大天然产物基因簇。与之前报道的三萜类基因簇不同，这一基因簇缺少骨架合成酶，为其他萜类天然药物的生物合成解析提供了重要参考。除此之外，基因簇中 AmOGD1 参与 AG IV 的生物合成说明了植物似乎不仅利用 CYP450 ，还利用 2-OGD 家族的成员修饰三萜骨架。同时，这些基因的挖掘和全合成途径的解析为后续的中药新品种选育及黄芪三萜创新药物研发奠定了坚实的药源基础。

黄胜雄课题组的 徐冰艳 博士研究生、 黄建萍 研究员、 彭国情 和 曹文颖 硕士研究生为本论文的共同第一作者， 黄胜雄 研究员为通讯作者，成都中医药大学 陈士林 院士和鲁南制药基团合作者为本研究提供了大力支持。上述工作得到了国家合成生物学重点研发计划、国家自然科学基金、云南省“兴滇英才支持计划”等项目资助。

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