零基础也可以来学CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术
2017年6月23-25日
(理论与实验相结合，比较适合从事动物植物细菌等微生物研究人员)
主讲人：赵庆顺
南京大学模式动物研究所
遗传学与发育生物学教授
学士（
1983-1987
年，南京大学）；
硕士（
1987-1990
年，南京大学）；
博士（
1996-2001
，普渡大学）；
2001-2003
年在杜克大学医学中心进行博士后训练；
2003
年全职加入南京大学模式动物研究，
2006
年晋升为教授。
往期学员评价
评价一
：
CRISPR/Cas9
系统是一种新兴的基因定点编辑技术，越来越被研究者所关注。在赵庆顺教授理论结合实际、幽默接地气的授课方式下，为期两天半的培训轻松且充实，让我从对
CRISPR/Cas9
技术的毫无所知，到对该技术原理及应用有了的全面认识；同时，结合开展的实验环节，掌握了
CRISPR
序列的设计，基因组编辑工具的制备及向细胞内递送的方法；熟悉了利用
CRISPR
技术在动植物中敲入和敲除的过程；了解了
CRISPR/Cas9
脱靶问题解决方案。通过本次学习，受益匪浅！
评价二
：有幸全程聆听赵教授的课，教授授课逻辑性非常强、条理清晰、讲解生动细致、内容丰富。教授知识面很广、知无不答言无不尽，绝对是个专业的研究学者。特别是对哪些技巧和注意哪些关键点讲的非常实用。比较适合从事动物植物细菌等微生物研究人员来学习。课程安排合理，由浅入深，适合不同人群，希望这个班能让更多的科研人员获益。
评价三
：我是
2016
年在上海参加过赵教授的学习班，因我基础比较差，在实际应用过程中遇到了很多的问题，非常感谢南京尧顺禹生物科技有限公司工作人用耐心细致的课后服务。
2017
年
2
月主办单位上海玮瑜生物科技有限公司谢老师告知我老学员可以终身免费继续学习，我又去了一次南京。真是每一次都有不同的收获，感谢感谢再感谢，也祝玮瑜公司越办越好。
本期课程安排
第一天
上午9:00-12:00
第一讲、基因组靶向修饰技术简介
1
、基因功能研究的分子遗传学技术简介
2
、基于
NHEJ
修复的基因敲除和基于
HR
修复的基因敲入
3
、
ZFN
和
TALEN
技术
4
、
CRISPR/Cas9
技术
第二讲、CRISPR的设计
1、目标基因结构及功能的生物信息学分析
2
、
CRISPR
的设计原则
3
、
CRISPR
的在线设计（可自带可无线上网之笔记本电脑或手机）
4
、靶向编辑基因的基因型确认及
CRISPR
的再设计
第一天
下午13:00-17:00
第三讲、基因组编辑工具的制备及向细胞内的递送策略
1、基因组编辑工具之
DNA
表达元件的制备与递送策略
2
、基因组编辑工具转录产物制备及递送策略
3
、基因编辑工具
RNP
的制备与递送策略
实验（或技术细节答疑）一：CRISPR/Cas9 基因组编辑工具All-in-One表达质粒的构建（1）
1
、
CRISPR
模板引物的准备
2
、
CRISPR
模板的制备
3
、退火
CRISPR
模板与线性化
CRISPR/Cas9All-in-One
载体的重组
4
、大肠杆菌的转化
5
、携带基因组编辑工具的转化子的涂板培养
第二天
上午9:00-12:00
第四讲、sgRNA活性验证
1、
体外法
2
、体内法
2.1
插入缺失（
Indel
）突变检测的基本策略
2.2
基于胚胎反应器的活性验证方法
2.3
基于细胞系的活性验证方法
实验（或技术细节答疑）二：CRISPR/Cas9 基因组编辑工具All-in-One表达质粒的构建（2）
基因组编辑工具之
CRISPR/Cas9All-in-One
重组子的快速验证法（
PCR
法）
实验（或技术细节答疑）三：基因组编辑子等位基因的基因型鉴定
1、
基因组
DNA
模板制备
2
、目标基因的基因组
DNA
片段的
PCR
扩增
第二天
下午13:00-17:00
第五讲、利用CRISPR技术创建基因组编辑人及动物细胞系
1
、创建基因组编辑细胞系的基本过程
2
、基因敲入的供体
DNA
的设计原则及基因敲入供体设计实例
3
、表达
CRISPR
的
All-in-One
表达质粒（和供体）导入细胞系的方法
4
、阳性细胞克隆筛选
5
、靶向突变的基因型鉴定及基因组编辑细胞系的建立
6
、敲入基因和敲除基因（无效等位基因）的确认
7
、建立基因组编辑细胞系的优选策略
第六讲、利用CRISPR技术创建基因敲除或敲入动物
1
、创建基因组编辑动物突变体的基本过程
2
、
sgRNA/Cas9mRNA
（和供体）共显微注射入受精卵中建立初建者
3
、初建者体细胞携带靶向突变等位基因的确认
4
、基因敲除
/
敲入动物（
F1
）的鉴定
5
、基因敲除
/
敲入动物品系（
F2
）的建立
6
、敲除
/
敲入基因的确认
7
、建立基因敲除或敲入突变体动物的优选策略
第七讲、利用CRISPR技术创建基因敲除或敲入植物
1、创建基因组编辑植物突变体的基本过程
2、双元载体的转染
3
、基因敲除/敲入植物（F1）鉴定
实验（或技术细节答疑）四：实验结果的点评与讨论
1
、
CRISPR/Cas9All-in-One
重组子的
PCR
产物电泳检测结果点评
2
、基因组编辑等位基因的基因型鉴定电泳检测结果的点评
3
、测序是验证基因组编辑结果的金标准
第三天
上午9:00-12:00（12:00以后课程结束）
第八讲、基因组编辑技术的脱靶问题
1、
脱靶的产生原因
2
、脱靶检测
3
、解决脱靶问题的方法
4
、脱靶问题对不同领域研究者的意义
