本文介绍了在标准小RNA测序实践中，iNature伴随的RNA降解产物的克隆是一个主要问题，阻碍了实验的可重复性和文库构建。复旦大学任国栋团队使用PBOX-sRNA-seq方法，发现新生miRNA-5p/-3p双链可能在HEN1介导的甲基化之前经历单细胞化/尿苷化。研究还发现了两种携带2'-O-修饰的5'-tRNA片段。PBOX-sRNA-seq方法在去除未甲基化的RNA物种和捕获2'-O修饰的sRNAs方面优于单独处理方法。该研究表明PBOX-sRNA-seq在植物sRNAs和动物piRNAs的定性和定量分析方面都是强大的。
在标准小RNA测序实践中，RNA降解产物是一个主要问题，它不仅使真实sRNAs的表征复杂化，而且阻碍了实验的重复性和文库构建。
复旦大学任国栋团队使用PBOX-sRNA-seq方法，该方法专门用于捕获sRNA的3'端2'-O-甲基化修饰，并在去除未甲基化的RNA物种和捕获2'-O修饰的sRNAs方面表现出优势。
研究发现新生的miRNA-5p/-3p双链可能在HEN1介导的甲基化之前经历单细胞化/尿苷化，涉及多个基因冗余作用。
研究发现了两种新型携带特定修饰的5'-tRFs，这些发现为未来小RNA生物学的研究提供了重要价值。
伴随的RNA降解产物的克隆是标准小RNA测序实践中的一个主要问题。这不仅使真实sRNAs的表征复杂化，而且阻碍了跨批次实验的可重复性，有时甚至导致文库构建失败。
2024年6月22日，复旦大学任国栋团队在
Nucleic Acids Research
在线发表题为
“
PBOX-sRNA-seq uncovers novel features of miRNA modification and identifies selected 5′-tRNA fragments bearing 2′-O-modification
”
的研究论文，该研究
使用PBOX-sRNA-seq，
发现新生的miRNA-5p/-3p双链可能在2'-O-甲基化之前经历单细胞化/尿苷化。还发现了两种高度保守的携带HEN1独立的2'-O修饰的5'-tRNA片段(tRF)(主要是13-nt tRF-5a
Ala
和26-nt tRF- 5b
Gly
)。
鉴于所有类型的植物典型小RNA都具有3'端2'-O-甲基化修饰，一种新的小RNA测序(sRNA-seq)方法被称为PBOX-sRNA-seq，专门用于捕获这种修饰。PBOX-sRNA-seq，顾名思义，依赖于在sRNA文库构建和测序之前，对RNA样品进行苯硼酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PBA-PAGE)和高碘酸钠(NaIO
4
)氧化的顺序处理。PBOX-sRNA-seq在去除未甲基化的RNA物种和以超高纯度捕获2'-O修饰的sRNAs方面优于单独处理(即仅使用PBA-PAGE或仅使用NaIO
4
)。
相信PBOX-sRNA-seq在植物sRNAs和动物piRNAs的定性和定量分析方面都是强大的。
除了少数物种(如拟南芥中的miR158)外，所有典型类型的植物小
RNA
(sRNAs)，包括microRNAs (miRNAs)和各种小干扰
RNA
(si
RNA
)，都是高度甲基化的。
甲基由HUA增强子1 (HEN1)沉积到sRNAs 3'端核糖的2'OH上(称为2'-O-甲基化，2'-O-Me)。pi
RNA
和一些种系相关si
RNA
也被甲基化。2'-O-Me对于维持sRNA的稳定性至关重要。在2'-O-Me受损的Hen1突变体中，由于3'尿苷化和3'至5'修剪的共同作用，sRNAs变得不稳定且长度不均匀。在植物中，Hen1抑制因子1 (HESO1)和UTP: RNA尿苷基转移酶(URT1)协同尿苷化非甲基化sRNA以加速其降解，而负责非甲基化sRNA修剪的酶尚未确定。
甲基化的miRNA可以被小RNA降解核酸酶(SDNs)截断，并进入尿苷化依赖的miRNA降解途径。
sRNA-seq是一种强大的s
RNA
全局分析方法。
虽然大多数水解产生的RNA降解产物含有5'-OH末端，并且在文库构建过程中不连接，但其他一些RNA降解产物是由内源性或外源性RNA酶的非特异性活性产生的，这些活性可能在生理上无关但可克隆。这种RNA降解产物的内含不仅降低了sRNA的比例，而且影响了实验的可复制性，有时甚至导致文库建设失败。
此外，来自非结构位点的降解RNA片段使sRNAs的表征和分类复杂化，特别是在基因组复杂且注释能力差的非模式植物物种中。
图形摘要（图源自
Nucleic Acids Research
）
鉴于许多类型的sRNAs都具有2'-O-Me修饰的独特特征，已经建立了特异性捕获2'-O-Me的方法来丰富2'-O-Me修饰的sRNAs。
采用NaIO
4
预处理选择性克隆2
'
-O-Me修饰的sRNAs。NaIO
4
氧化含有2'-3'顺式二醇(2'，3'-OH)末端的未修饰
RNA
，从而在文库构建过程中阻断它们与3'接头的连接。然而，高浓度的NaIO
4
可能会导致意想不到的RNA断裂。作为一种替代方法，PBA-PAGE系统已被用于从果蝇中丰富的~ 31 nt 2S rRNA中分离pi
RNA
。PBA与未修饰的
RNA
(即含有顺式二醇的
RNA
)相互作用并阻碍其迁移，但不与2'-O-Me修饰的
RNA
相互作用。
虽然这两种方法都有效地富集了2
'
-O-Me修饰的sRNAs，但它们去除未修饰
RNA
的功效尚未得到全面评估。
研究比较了PBA-PAGE选择和NaIO
4
氧化的效果，无论是单独的还是联合的，然后进行了文库构建和深度测序。
结果表明，PBOX-sRNA-seq组合策略可获得最纯的2'-O修饰sRNAs富集。通过这种方法，研究发现新生的miRNA-5p/-3p双链可能在HEN1介导的甲基化之前经历单细胞化/尿苷化，这可能涉及HESO1、NTP6和NTP7的冗余作用。研究还发现了两个进化上保守的5'-tRFs，主要是13-nt tRF-5a
Ala
和26-nt tRF-5b
Gly
，它们具有不依赖于HEN1的2'-O修饰。
这些发现和技术对未来小RNA生物学的研究具有重要价值。
参考消息：
https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkae537/7697532
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