冷冻电镜cryo-EM三位科学家获2017诺贝尔化学奖
张凯（剑桥MRC分子生物学实验室）| 撰文、翻译等
（1）Richard Henderson：
蛋白质电子晶体学 + 首个膜蛋白helix及电镜原子结构 + 冷冻电镜信息极限理论 + 直接电子探测器。。。其中细菌视紫红质的跨膜helix比第一个膜蛋白x-ray结构早10年，但到原子结构却耗时15年，后来X-ray的第一个膜蛋白结构拿诺奖了。。。但是，从历史全局观来看，现在的冷冻电镜把X-ray几十年的活瞬间干完了，谁的影响力更大，领域内的人都心知肚明。
（2） Joachim Frank：
单颗粒分析鼻祖，冷冻电镜最早的程序包Spider的作者（大约50多年前开发）。当年Richard 和 Nigel一开始也走上了电子晶体这条不归路，但是电子晶体学对样品要求极为苛刻，不太可能具备“普适性”（牛神也会走弯路滴，我们怕啥，呵呵）。一般而言，越底层的概念越普适，Joachim提出了一个现在看来就跟“常识”一样的观点，他认为可以不用晶体结构，直接对电子成像中的“散在的单颗粒 ”做对位（alignment）及平均来降低噪音，从而有可能获得准确取向，进而获得三维结构。作为冷冻电镜技术的基本思路，这个是非常fundamental的概念，而且完全绕过了晶体学对样品苛刻的结晶要求，使得这种方法能够处理general 的case，而不是special case，现在单颗粒电镜图像处理无论如何都饶不开这个基本概念。另外Joachim Frank在核糖体结构机理方面的贡献功不可没，虽然早年没有晶体学分辨率高。但是由于冷冻电镜革命，目前差多一天就可以解析一个核糖体结构，其影响力可见一斑！
（3）Jacques Dubochet：
虽然Bob Gleaser 和Ken Taylor是最早提出样品冷冻概念的，但是他们的方法并没有真正的work。目前认为，第一个发明真正意义上的有效的样品冷冻方法是Dubochet ，他系统研究了冰在各种冷冻条件下的状态，使得生物样品最终能够在无定形的冰中稳定存在、保持其原有的天然结构，保证样品能够成功成像。这个方法一直沿用至今，至今冷冻电镜的小盆友们每天用的方法和30多年前的其实本质上没什么两样，只不过是自动化程度更高了而已。
我前天在微信朋友圈曾大胆押了三个诺贝尔化学奖奖候选人，全部命中！
全部命中！
！！
--------------------------------------------------------------------------------------------------
下面附上Richard Henderson教授对冷冻电镜的10分钟介绍视频
：
By Richard Henderson
张凯 | 翻译
冷冻电镜技术利用了电子显微镜这个工具（仪器）。很显然，在1900年电子被J.J.汤姆森（Thompson）发现以前，这个概念是不可能被提出的。一旦人们从波粒二象性原理出发，弄清楚电子也可以像光波一样被聚焦后，恩斯特·鲁斯卡（Ernst Ruska）便提出了电子显微镜这个概念。利用电子来成像有极其显著的优势，因为它的波长只有大约光波的10万分之一左右；大体上光波为1微米级别（注：可见光约400～760nm），而电子约为1皮米（10^-12米）。
原则上，你可以获得远远高于光镜的分辨率。但是，从技术上而言具有诸多挑战。直到大约上个世纪五六十年代，电子显微镜才可以解析一些原子结构。生物学家总是落后于其它学科（利用电子显微技术），那时的电镜用户主要集中在金属或类似的材料研究。原因是这样的：当你把有机分子组成的生物样品置于电子束之下进行成像之时，它会产生辐射损伤而毁掉生物样品的结构信息。在早期的大量尝试最终都以失败而告终。所有的成功应用都是对生物结构进行重金属染色之后再成像，这借鉴了材料科学家们的研究方法。
直到美国科学家Bob Glaeser出现才改变了这个局面，他目前仍在伯克利。他曾指出辐射损伤意味着穿过样品的电子将破坏其化学键，改变原有结构信息（比如蛋白、脂等等），将它们“烧掉”。所以，氢键会被破坏，变成了气体，留下的只有一些结构残骸。Glaeser教授指出，由于辐射损伤的存在，你永远无法测定单个分子的结构。所以他提出使用晶体，通过这种方式，你可以弄清楚电子是如何和这些结构相互作用。这种情况下，你就拥有数十万个规则排列的分子。即使其中的一部分子结构被破坏，你也可以从中得到目标分子的结构信息。
Glaeser是最早和他的学生尝试利用冷却样品来克服或降低辐射损伤的科学家。他们把样品冷却到了大于-100°C。这是他们当时所能够达到的极限，因为当时电子显微镜的真空极差，样品会被严重污染。直到上个世纪80年代，随着更好的真空系统、更好的冷台（用于冷却样品并使其保持低温）的出现，样品被冷却至液氮温度才变成可能。这主要归功于坐落于海德堡的欧洲分子生物学实验室（European Molecular Biology Laboratory，EMBL）的Jacques Dubochet教授及其研究组。
他系统研究了水在冷冻条件下的各种性状，研究了大概3-5年才有了结论。他指出：“当你冷冻水的时候，它常常形成冰晶；有时候，这是六边形的晶体；有时，是立方的晶体；但是，如果你非常迅速地冷冻液态水，它可以形成无定形的冰”。他发明了一种方法，利用吸附的方式形成薄的水膜，然后快速插入到冷却液体。起初，他们尝试了液氮，但是液氮温度通常都处于沸点附近，冷却表面形成大量气体，冷却速度极慢，这会导致冷却之后常常得到冰晶。后来他发明了我们目前广泛使用的生物样品冷冻方法。这个方法中，直接用于冷冻样品的是液态乙烷或丙烷，它们处于液氮环境，并被冷却至和液氮相当的温度（注：乙烷熔点约-183°C，液氮沸点约−196°C）。
我认为，Dubochet教授的工作标志着冷冻电镜技术真正的开始。那时候我们正在从事细菌视紫红质的二维晶体研究（注：Henderson与其合作者Nigel Unwin 1975年首次观测到细菌视紫红质七次跨膜螺旋结构）。我们刚开始是在室温环境进行研究，并没有对晶体进行冷却。当我们尝试把晶体冷却至液氮温度之时，我们获得了大约4-5倍于室温环境的可用数据。所以，事实上冷却并没有彻底克服辐射损伤，只是把损伤的程度降低了大约4-5倍。然后，我们利用冷冻电镜技术成功解析了这个二维晶体的结构(Henderson et al., 1990)。
但是，冷冻电镜真正的强大之处在于它可以“冷冻一切”！你可以冷冻生物组织小碎片，你可以冷冻溶液中的分子，你可以冷冻重悬后的病毒，你可以冷冻核糖体。事实上，你可以做任何你想做的事情。所以目前冷冻电镜可研究的范围至少覆盖了四五种不同的生物样品种类。每一种自身都非常有意义，并且可以从不同的侧面帮助你洞悉生物对象，提供重要结构信息。
最简单的一种方法就是冷冻我们现在称为“单颗粒”的悬浮分散对象。以核糖体为例，细胞中各种各样的蛋白质都在这里被合成。你可以把核糖体冷冻在一个很薄的水膜中，这样你就可以看到各个不同方向的核糖体的二维投影图。你可以从照片中挑选出一个一个核糖体的“单颗粒”；如果数量足够，比如目前大约需要1-2万个，你就可以将这些各个不同方向的核糖体平均，进而得到三维结构。
基本原理和CT（computer tomography）非常像，假如说你不幸得了脑瘤，需要去医院用X-射线从不同方向来照射成像，然后通过这些投影像，反过来可以得到你的大脑、眼睛和肿瘤的三维像。我们事实上是用冷冻电镜做类似的事情。你可以对单颗粒应用类似原理，这不需要任何对称性，但是前提是你必须得到各个不同的方向的图像。
另外一些生物结构的例子则拥有内在的对称性。比如，许许多多的病毒它们都具有正二十面体对称性。这意味着它们自身拥有五次、三次和二次旋转对称轴，每个颗粒本身就拥有60重拷贝数。所以如果你对一个正二十面体病毒进行成像，实质上你得到了相当于60个不同方向的结构信息。这也就意味着你可以用少于普通样品60倍的颗粒数得到类似的三维结构。
另外，你可以得到许多具有螺旋排列方式的生物结构。例如alpha-螺旋，肌肉中的微丝结构等。肌肉中你可以看到细肌丝和粗肌丝，如果它们相对滑动，就意味着你的肌肉正在收缩。这些对象都可以很好的利用冷冻电镜来研究。我们看到一根根的螺旋结构，你对它们进行成像拍照，然后进行平均处理。但是你必须找准它们的取向，这是一个螺旋结构，你可以利用亚基之间的空间排布的几何性质进行约束，定位它们之间的相对取向。
另外一种分子间的排布方式是二维晶体。这种情况下，蛋白形成单分子层状结构，通常我们把其中一个称为a-轴，另一个则称为b-轴。这就是所谓的电子晶体学（electron crystallography）。起初，这种方法实际上更加简单，因为在同一个方向上，你可以获得上万个分子的图像。
最后一种方式和单颗粒、螺旋结构、二维晶体等都有一定区别，但它却是适合一切结构研究的一般情况。人们把这种方法称作电子断层成像技术（cryo-electron tomography）。这意味着你对单一的生物样品成像，不需要大量重复结构或拷贝数。你只是简单地对目标对象从不同的角度成像，比如，-70度到+70度，然后就像CT重构脑瘤一样。
这大体上就是目前冷冻电镜所能研究的生物对象的范围。利用这类冷冻电镜相关的方法，我们现在可以研究上百甚至上千种不同类型的生物分子结构。而这些结构曾经无法利用其它方法获得，比如X-射线晶体学，核磁共振等。冷冻电镜在过去几年出现了一系列重要的技术进展，现在的程序比以前更好更强大；不过，更加关键的是新一代的直接电子探测器的诞生。和传统的胶片不同，我们现在拥有了基于硅芯片的固态的探测设备。这大大提高了图像的信噪比。这些技术发展导致了“分辨率革命”，Werner Kühlbrandt教授在2014年的一篇综述中这样称道(Kuhlbrandt, 2014)。
在2010年以前，你可以获得一些稍大的结构的高分辨结构（比如正二十面体病毒），但是你很难得到小的分子结构，它们最终倾向于变成一坨模糊不清的轮廓图。这也是为什么冷冻电镜的科学家们常常被嘲笑为“轮廓砖家”。但是现在，“冷冻电镜革命” 实实在在地发生了，结构生物学家正在一窝蜂地涌向冷冻电镜革命的战场。出于这个原因，现在有大量并不具备任何冷冻电镜背景的研究人员正在不断地加入这个领域；同时也有大量的研究机构、大学、研究所等相关部门都在投资建设冷冻电镜研究平台。这导致了目前冷冻电镜领域人才出现“供不应求”的现象，有大量的研究中心甚至无法得到足够的人力支持。所以我们可以断言：冷冻电镜已经成为一项非常强大的方法，或许，已经主导了结构生物学。
另附Richard Henderson 教授个人八卦
图为Richard Henderson获得科普利奖时接受采访所拍摄
人物背景：
理查德·亨德森（Richard Henderson），剑桥MRC分子生物学实验室教授，苏格兰人，生于1945年。1983年，年仅38岁的Henderson当选英国皇家学会院士。2016年，英国皇家学会决定将当年的科普利奖章（Copley Medal）颁发给Richard Henderson。
2017年被授予诺贝尔化学奖！
科学生涯：
Richard Henderson是典型的“纯粹科学家”，科学生涯几十年，一直坚持在一线亲自做实验，大量成就均以第一作者、甚至唯一作者发表论文（注：在生物领域，对于非理论研究而言，这意味着Henderson教授本人就是科学实验或数据分析的实际执行者，通信作者一般意味着研究内容的指导和统筹规划）。1975年， Henderson与其合作者Nigel Unwin利用电子显微三维重构技术首次获得7埃分辨率的细菌视紫红质3D结构(Henderson and Unwin,1975)。这是人们首次观测到膜蛋白的跨膜螺旋结构，也是人们首次利用该技术看清楚生物对象的二级结构。当时Henderson教授做出这项成果的时候，冷冻电镜还没有诞生，样品辐射损伤极其严重，只能依靠二维晶中大量规则排列的分子平均效应抵消辐射损伤影响。在当时的环境能完成这样的创举，在今天看来都是一件不可思议的事情。
80年代中期，冷冻电镜技术诞生；Henderson教授也在随后解析了冷冻状态下的3.5埃分辨率的细菌视紫红质二维晶体结构(Henderson, R. et al, 1990)。稍稍有点遗憾的是，那个年代，电镜技术完全处于萌芽状态，分辨率上还无法和X-射线晶体学媲美，最早的跨膜螺旋只有7埃，对解释原子层次的机理存在一定困难，而从7埃推进到3.5埃近原子分辨率却整整花了15年时间。虽然Henderson第一个观察到跨膜螺旋，但是先于他的3.5埃分辨率结构，第一个膜蛋白3.0埃分辨率的原子模型却是德国科学家米歇尔研究组于1984年利用X-射线晶体学完成的（Deisenhofer, J. et al, 1984）。米歇尔随后获得1988年诺贝尔奖。八九十年代是Henderson重要的转型期，他并没有因为X-射线晶体学的强大技术压力而放弃冷冻电镜相关研究。相反，他深刻地洞察到冷冻电镜可能在未来会成为“极具前景的、更加强大的技术”，他的重心也在随后转向了和冷冻电镜相关的原理、理论和方法研究。
这也从一个侧面反映了Henderson教授研究风格极具前瞻性和深刻洞察力，纯粹以彻底解决科学、理论或技术问题为导向，完全不以发文章为目的，其研究论文也从不“灌一篇水”，更不随便署名一篇论文。他是极其典型的“完全不跟风型”的科学家，因为他“无风可跟”，他就是“狂风暴雨的创造者”。在近几年这场浩浩荡荡的所谓“冷冻电镜革命中”，Henderson教授没有一篇Nature，Science这些所谓的“高大上”的文章，并且曾拒绝在自己博士后的两篇关于超大膜蛋白复合物的Nature论文上署名。虽然他也对这些研究成果也大加赞赏，但认为不属于自己目前的研究范畴，不应该因为作者是自己的博士后而随便署名。尽管Henderson近些年的“publication”完全算不上“耀眼”，但每一次冷冻电镜领域有重大突破或具有巨大争议性的研究结果，第一个被邀请“出山”的便是Henderson教授。
而这样一位从不贪图一篇CNS、不灌一篇水、不随便署名任何一篇所谓“高大上”、“奢侈”、“高影响因子”论文的科学家，却是目前整个领域公认的诺贝尔奖得主的最佳候选人之一（假如未来几年诺奖颁发给冷冻电镜）。事实上，Richard Henderson早在20多年就已经预见了“这场革命”。作为分子生物学家出身的Richard Henderson在上个世纪七八十年代便做出了一系列大分子结构研究的里程碑式的工作，并且深刻地洞察到冷冻电镜在未来生物大分子结构研究中的关键意义，毅然决然地于上个世纪八九十年代全面转型发展冷冻电镜相关的理论、技术和方法，并给出了一系列理论和实验上的准确预言(Henderson, 1995)。在冷冻电镜基本原理、理论和方法，图像处理算法和软件均有重要贡献，尤其是在直接电子探测器方面有着“不可替代”的关键影响力。90年代末，在一次3D电子显微镜的GRC（Gordon Research Conference）会议上，同领域一位科学家在报告中悲观提到：“冷冻电镜技术非常有限，不可能超越像X射线晶体学这样强大的技术手段”。Richard Henderson在下一场发言中开门见山，毫不客气地说他完全不同意该观点，并给出了自己的理解和一系列客观严谨的研究结论，并且十分自信地预言:“冷冻电镜会超越其它各种技术，成为蛋白结构研究的主导工具”。20多年以后，在这场冷冻电镜的“革命”中，人们用事实证明了Henderson在上个世纪90年代大量的研究和预言的准确性。当然，随着技术的进一步发展，有的结果甚至超出了Henderson当时的预言。
提携年轻学者：
Henderson教授不仅在科学研究方面具有深刻的洞察力和远见卓识，对年轻一辈的学者鉴赏也颇具慧眼，并且能实质性地促进其职业发展。一个典型的例子就是Sjors Scheres 博士。当年多多少少由于publication的原因，他在西班牙那些其实并不具备国际竞争力的研究机构无法获得一份教职，却得到Henderson大力赏识，成为Henderson教授为剑桥MRC分子生物学实验室亲点的“潜力股”，并于2010年正式入职；两年后，Scheres博士拿出了冷冻电镜领域经典之作Relion程序，再两年之后，Scheres入选2014年Nature杂志评出的“十大科技人物”。
Henderson教授不仅仅鼓舞年轻人、促进其职业发展，他甚至“鼓舞”了整个领域。早期的电镜技术根本无法研究生物结构，Henderson则用事实证明了其可行性，在70年代冷冻电镜技术尚未出现以前，便获得了七次跨膜螺旋结构。80年代冷冻电镜技术诞生以后，很多传统的结构生物学家依然不看好这项技术，甚至一度嘲笑其为“blobology”（英文讽刺词语，意思是“只能看见一坨轮廓的技术”）。而Henderson就是那个“逆潮流而行的未来开创者”，直接着眼20年后，并且用事实一次又一次鼓舞整个领域保持乐观心态向前发展、着眼未来。
个人八卦：
Henderson教授在同领域其他“大牛”眼中的地位到底如何呢？凯哥也八卦一下多年前参加电镜学习班时的一个插曲。那时，大家都在会后开啤酒聊天、自由讨论，有位大牛发现Henderson被围着，手头没有拿到beer，十分着急，赶紧去帮Henderson开beer，然后顺便说了一句略带玩笑的话：任何人的beer你们都可以自己去开，但Richard的beer我必须要亲自为他开”。话说这位大牛自己本身也是皇家院士...
另外再八卦一些实验室里发生的小细节。按道理，一个人38岁当选皇家院士，这种履历早就风光无限，瞬间秒杀一切同行，仅凭其学术威望就有可能轻而易举获得大量人力财力物力等等方面的支持。但是Henderson教授亲自在一线做研究、做实验的习惯一直保持到现在。Henderson教授今年已经72岁，凯哥还经常在半夜两三点看到他在电镜室做实验。这种情况必须发生在两个人同时熬夜的前提下，按道理应该是小概率事件。所以好奇之下，凯哥估算了一下自己熬夜的先验概率，以及凯哥在场情况下观测到Henderson教授熬夜的条件概率，然后计算出Henderson教授单独熬夜做实验的先验概率，着实吓了一跳！
好了，不扯太多八卦了，已经大致介绍过了冷冻电镜领域这位泰斗。下一次，凯哥将和大家分享Richard Henderson教授有关冷冻电镜的一段十分钟的视频介绍。凯哥已经将Henderson所讲的内容，逐句对照意译为中文，希望对读者有所帮助。下回见！
科普利奖简介:
该奖始于1731年,为科学界最古老的权威奖项，已有近300年历史。颁奖不分学科，所有学科一起参评，每年只颁发一人，爱因斯坦、达尔文、高斯、法拉第、门捷列夫、普朗克、沃森、克里克、桑格等等划时代的科学家都曾获得该奖。目前该奖通常只颁发给已经获得诺贝尔奖的科学家（也就是说一般情况下是从诺奖得主中二次筛选），Richard Henderson是极少数的例外之一，另一个例外是黑洞蒸发理论提出者史蒂芬·霍金。
参考资料：
Henderson, R. (1995). Thepotential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomicresolution microscopy of unstained biological molecules. Q Rev Biophys 28, 171-193.
Henderson, R., Baldwin, J.M., Ceska, T.A.,Zemlin, F., Beckmann, E., and Downing, K.H. (1990). Model for the structure ofbacteriorhodopsin based on high-resolution electron cryo-microscopy. J Mol Biol 213, 899-929.
Henderson, R., and Unwin, P.N. (1975).Three-dimensional model of purple membrane obtained by electron microscopy.Nature 257, 28-32.
Kuhlbrandt, W. (2014). Cryo-EM enters a newera. Elife 3, e03678.
https://en.wikipedia.org/wiki/Copley_Medal
https://www.timeshighereducation.com/people/interview-richard-henderson-university-of-cambridge#survey-answer
注：本文由微信公众号“冷冻电镜cryoEM”授权BioArt转载，感谢张凯博士的支持！
扫下方二维码可关注冷冻电镜微信公众号：
