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晚期NSCLC患者，EGFR通路介绍——EGFR 突变检测技术汇总

抗体圈 · 公众号 · 医学 · 2017-11-19 07:30

正文

◆ 同学们，上期大家提到对各种EGFR突变检测技术很感兴趣，大家在工作中或者文献中都遇到过那些检测技术呢？

◆ 大家已经列举了常见的EGFR突变检测技术。其实分子检测的一大难题是“Too small to see”。怎么办呢，我们需要放大，就会用到一个基础技术叫”PCR “。关于PCR大家有多少了解呢？

◆ 教授，我知道， PCR 是聚合酶链式反应！

◆ 在试管中加入 DNA 模板，引物，酶，核苷酸原料 (ATCG), 经过固定的变温反应程序，使 DNA 片段大量扩增。

◆ 小 B 医生的解释很对，分子是微观水平，如果不进行有效的放大，我们是很难检测到它的，所以 PCR 技术的放大，是很多分子检测技术的基础。

◆ 了解了PCR技术后，EGFR突变检测技术的第一种，直接测序法就很好理解了！

◆ 我知道了，直接测序法就是先用PCR把要检测的EGFR的片段扩增，成百万倍的放大后，再用Sanger测序法测序就可以了！

Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见DNA碱基序列的一种方法。

◆ 我记得几年前，EGFR突变检测就是用的直接测序法，为什么现在很少用了呢？

◆ 直接测序是基因检测的金标准，它可以获得你感兴趣基因片段的完整基因序列，所以可以发现未知的突变。

◆ 但是由于组织、细胞有异质性，例如只有少部分EGFR基因有突变，而PCR非选择性的把所有的EGFR基因都扩增了，这样突变基因比例低时，可能测序就测不到了，出现假阴性。

◆ 另外这种技术检测通量低，费时、费力也是被淘汰的一个主要原因。

◆ 教授，现在我们临床上用的最多的是ARMS的检测方法，您能讲讲它的原理吗？

◆ ARMS方法也是基于PCR技术的一种检测方法，利用的是Realtime PCR，所以我们还是先了解一下RealtimePCR的原理。

◆ 教授，看上去realtime PCR像是普通PCR的升级啊！

◆ 是的，Realtime PCR较传统PCR有两大优势

- 相对定量：根据释放荧光的量

- 通量更高：可以同时进行96，甚至384个反应

◆ 原来ARMS检测方法利用了更高级的平台呀！

◆ 我知道了ARMS方法比直接测序法检测通量高，所以现在更普及，是吗？

◆ 小B医生说对了一半，通量高是ARMS检测技术的一个优势，但不全面，下面我们就仔细了解一下ARMS技术。

◆ ARMS叫做扩增受阻突变系统 ( amplification refractory mutationsystem)， ARMS引物只有与突变模板结合后延伸反应才能进行，如果与野生的模板结合延伸反应不能进行，表现为扩增受阻。

◆ 扩增受阻的优势: 选择性的只扩增了突变模板，避免了野生模板的干扰和引物消耗，增加了检测的敏感性。

◆ 我明白了，这样不需要测序，我们只要需要看ARMS引物有没有扩增，根据产生荧光信号就知道是否有突变了！

◆ 因为PCR扩增的敏感性高，所以如果没有野生EGFR基因的稀释效应，哪怕只有低比例的EGFR突变，也可以被扩增并且检测到！

◆ 教授提到Realtime PCR平台的检测通量很高，可以一次进行多个反应，那么是不是可以将不同的突变一次进行检测，这样就节省了时间？

◆ 小B医生的想法非常好，实际检测中也正是这么做的，我们针对每个突变位点设计ARMS引物，现在临床上用的检测试剂盒，通常可以同时检测多种常见的EGFR突变，并且可以同时对多个样本进行检测。

◆ 我知道了，ARMS方法有两大优势，灵敏度高，检测通量大！所以很普及。

◆ 教授，ARMS方法有什么不足吗？

◆ 从前面的介绍中我们了解到ARMS方法需要提前设计好ARMS引物，我们只有知道了突变的基因型才能针对它设计特异的ARMS引物，所以ARMS方法只能检测到已知的突变。

◆ 下面我总结的国内常见的ARMSEGFR突变检测试剂盒！

◆ 教授，原来ARMS检测方法是基于realtime PCR的平台，那ddPCR是什么呢，跟普通PCR和Realtime PCR有什么不同呢？

◆ 如果把Realtime PCR叫做二代PCR，那么ddRCR就是三代PCR。ddPCR能精确地测定样品中的DNA分子个数，实现了绝对定量。

◆ 听起来很不可思议，它是怎么做到的呢？

◆ ddPCR(Droplet Digital PCR) ：微滴式数字PCR

- Droplet, 反应体系被分为数千个微滴，每个微滴的target DNA不超过一个，微滴作为独立的反应体系进行扩赠

- Digital，通过数码的荧光计数，bright-有DNA分子，dark-无，bright的数量即绝对分子数目。

- 所以用 ddPCR监测EGFR突变，就可以准确知道突变基因的含量。

◆ 教授，最近NGS二代测序真是非常火，也可以检测EGFR突变，但是做一次检测那么贵，值得吗？

◆ 首先我们要明确的是NGS不仅仅可以检测突变，它还可以用来检测基因插入或缺失，拷贝数变异以及基因重排。所以能过同时检测多种基因异常是NGS的一个优势！

◆

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