激酶抑制剂类抗肿瘤药物耐受中的表观遗传调控

激酶（Kinases）在细胞内信号传递过程中起到关键作用，功能遍布细胞生长、增殖、分化和凋亡的全过程，能够接受细胞内外的各种信号，作出反应并传递下去。激酶的主要作用就是将来自于ATP的磷酸转移到相关底物分子上去，实现底物分子的磷酸化。随着研究的深入，研究者发现人类基因组中包含518个激酶，不同的激酶能够在不同的底物上面实现加磷酸的作用，这些底物包括不同的蛋白、脂类、糖链甚至DNA和RNA等核酸 [1-2]。

随着肿瘤发病机理研究的不断深入，越来越多的激酶的变化被证明是肿瘤的直接导火索，例如：

Src： 酪氨酸激酶（Tyrosine Kinase），首个被发现的致癌基因。

HER2/ERBB2： 受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK），在乳腺癌等癌症中突变。

EGFR： 非小细胞癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）等癌症中突变。

BRAF： MAP3K，黑色素瘤（melanoma）中激活型突变。

正因如此，目前为止许多激酶的抑制剂特别是小分子抑制剂被用于癌症治疗。按照抑制剂结合位点分类，主要有以下四类：

这其中应用最广泛的药物之一就是慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）的靶向药物伊马替尼（imatinib）。Imatinib是Type II抑制剂，主要靶向人体染色体交叉易位产生的BCR/ABL融合基因。

Fig. 1 激酶、信号通路及靶向药物

肿瘤病人对于激酶抑制剂类药物常常出现耐药性，这种耐药性经常来自于肿瘤细胞有关通路的基因突变。Fig.2a展示了黑色素瘤、乳腺癌、非小细胞癌等肿瘤细胞中的激酶通路变化，包括BRAFV600E的激活突变，EGFR、HER2等受体激酶等水平提高等。相应的，这些激酶的靶向抑制效果会被突变影响：

1）EGFR inhibition（EGFRi）： EGFR、下游Ras、PI3K、AKT等蛋白的激活型突变，以及PTEN缺失

2）BRAFi和MEKi： MEK的激活型突变

3）受体酪氨酸激酶（RTK）过表达

经统计，这些导致抗药性的激酶通路变化首先体现在基因水平上的变化，包括抑制型突变，激活型突变，以及可变剪接。

突变举例：

1）抑制型突变：

CML主要病因是BCR蛋白和激酶ABL形成了BCR-ABL融合蛋白。ABL的T315L突变破坏了抑制剂imatinib的结合位点，导致imatinib和二代靶向药物达沙替尼（dasatinib）等抗药性的产生。NSCLC肿瘤细胞中的突变EGFR ^T790M 和胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumors，GIST）中的突变c-KIT ^T670I 也均与此类似。

2）激活型突变：

例如许多抗药性细胞中发现有BCR-ABL或者BRAF ^V600E 的拷贝数增加（Fig. 2b）；

NSCLC的EGFR inhibitor耐药株中，RTKs拷贝数相应增加（Fig. 2b）；

BRAF inhibitor或者MEK inhibitor耐药株中，出现MAP3K8的异常激活（Fig. 2b）。

Fig. 2 不同药物耐药性产生的突变机理

3）adaptive or acquired resistance mechanism

许多耐药型的肿瘤中发现激酶的拷贝数增加，称为adaptive resistance。例如，以PDGFRB（platelet-derived growth factor receptor beta）为代表的RTKs在抗BRAFi和MAPKi的黑色素瘤中、抗MEKi的乳腺癌中都表达上升。在抗MAPKi的耐药株中，MITF（melanocyte lineage transcription factor）等转录因子水平上升；必须要同时抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和组蛋白去乙酰化酶（HDAC），才能拮抗耐药（MAPKi联合HDAC用药）。

Adaptive耐药性的产生一般是一个长时间的过程，即肿瘤患者和肿瘤细胞需要在同种单一的抑制剂处理之下，经历一段时间累积获得，这段时间可能是几周、几个月甚至数年，取决于患者本身的基因组和处理方法本身（Fig. 3）。

目前已经有多个研究证明表观遗传因子与耐药型相关：

① 组蛋白去甲基化酶KDM5A：Sharma等 [3]报道了吉非替尼（gefitinib）处理的非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer, NSCLC）细胞系逐渐积累EGFRi抗性的过程中，肿瘤干细胞标志物和KDM5A都表达上升，提示了抗性肿瘤细胞中的组蛋白修饰和染色质结构可能都已经发生了变化。

② KDM5B：BRAFi抗性的黑色素瘤细胞中存在KDM5B的表达[4]。

③ 溴结构域及外端结构域（BET）抑制剂，能够抑制组蛋白乙酰化识别蛋白BET的活性：能协同促进BRAFi的抗肿瘤作用[5]。

Fig. 3 肿瘤细胞抗药性产生机制图示

表观遗传调控一方面能够修饰DNA和组蛋白，另一方面也能够改变染色质构象；已经发现以下表观遗传因子与抗药性相关：

1）NSD2，BET蛋白：

雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性的乳腺癌（MCF7细胞）中，BET蛋白BRD3和BRD4能够招募H3K36一甲基化和二甲基化的甲基转移酶NSD2，在gene body区催化第36位赖氨酸的甲基化，促进转录。因此BET抑制剂例如JQ1等，可以与氟维司群（fulvestrant，雌激素受体拮抗剂类抗肿瘤药物）联合用药，用于肿瘤治疗[6]。

2）EZH2：

急性粒细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）的抗米哚妥林（midostaurin，PKC抑制剂）细胞中，甲基转移酶EZH2（enhancer of zeste homolog 2）被CDK1磷酸化后经过蛋白酶体途径降解。这导致EZH2调控的下游基因ABCC1（multidrug transporter，药物转运作用） 水平相应降低，影响药效。因此蛋白酶体抑制剂硼替佐米（bortezomib）和CDK1抑制剂CGP74514A都可以应用于协同用药治疗抗药性的AML[7]。

3）SWI/SNF蛋白:

主导染色质结构重塑；SMARCA4，能与HDACs和KATs（乙酰转移酶）相互作用，参与肿瘤细胞抗性[8]。

4）不同表观遗传标记的相互影响：

比如胶质母细胞瘤（Glioblastoma）中K27位的去甲基化酶KDM6表达增强，导致H3K27甲基化水平下降、乙酰化水平上升，促进转录起始[9]；多发性骨髓瘤（multiple myeloma）中H3K36me2水平上升，相应的H3K27me3水平下降[10]；急性白血病中H3K4me3水平下降伴随着H3K79me2水平上升[11]。

总结以上表观遗传因子以及其结合的区域，整理出adaptive response gene (ARG)转录调控过程中的super-enhancer模式，可以作为药物靶点：这其中包含了super-enhancer和promoter上的H3K27Ac以及识别蛋白BRD4，H3K27甲基化酶EZH2/PRC2和去甲基化酶KDM6，去乙酰化酶KAT，结合在基因区的H3K36me1/2和转乙酰酶NSD2/3，CDK9，以及控制核小体结构的BRG1等等蛋白（Fig. 4a）。

如Fig.4b，拓扑学相关区域（Topologically associating domains, TAD）和Super-enhancer区域以及其调控表达的直接基因所在的DNA和染色质区段能够被黏连蛋白cohesin、及CCCTC结合蛋白CTCF与其他区段分隔开来，以阻断相关元件对其他临近基因的转录调控[12]。胶质瘤（glioma）中发现异柠檬酸脱氢酶1（isocitrate dehydrogenase 1 , IDH1）的表达上升，抑制5’甲基胞嘧啶羟化酶TET的活性，导致包括CTCF结合区在内的DNA甲基化水平升高，TADs结构异常，进一步引起PDGFRA的表达升高，并且这种肿瘤能够被TET抑制剂5-氮杂胞苷（5-azacytidine）所抑制[13]。

Fig. 4 耐药性中的表观遗传修饰和相关因子