乳酸乳球菌菌表达系统Protocol

编辑 | 澹泊研究僧

乳酸乳球菌是一种安全的食品级微生物，具有生长快、易操作和遗传背景清晰等特点。这些特性使其成为基因工程菌的理想选择，用于生产医药及食品领域的多肽、酶和其他生物活性物质。

乳酸乳球菌表达系统的诱导与调控是实现外源基因高效表达的关键， 常见的诱导方式包括 乳糖诱导、Nisin诱导、pH诱导、盐诱导 等。

(1) 乳糖诱导: 乳糖诱导的表达系统是最具代表性的乳酸乳球菌表达系统之一。它利用乳糖操纵子(Lac)的调控机制，通过乳糖或其代谢物激活启动子，从而诱导外源基因的表达。该系统具有高效、可控和易于操作等优点。

(2) Nisin诱导: Nisin是一种由乳酸链球菌产生的天然抗菌肽，具有广泛的抗菌活性。Nisin诱导的表达系统利用Nisin作为诱导物，通过激活特定的启动子(如nisA启动子)来诱导外源基因的表达。该系统具有严格的调控性和安全性，适用于食品级基因表达。

(3) pH诱导和盐诱导: 除了乳糖和Nisin外，pH和盐浓度也可以作为诱导因素来调控乳酸乳球菌表达系统的基因表达。这些诱导方式通常利用受pH或盐浓度调节的启动子来实现对外源基因表达的调控。

乳酸乳球菌表达系统的构建通常涉及以下几个关键步骤 ：

(1) 选择适当的受体菌 : 受体菌通常为乳酸乳球菌的某种菌株，如NZ3000、NZ3900等。这些菌株通常具有特定的遗传背景，如缺失了某些基因或具有特定的抗性。

(2) 构建表达载体 : 表达载体是携带外源基因并在乳酸乳球菌中表达的DNA分子。它通常包含启动子、终止子、选择标记和克隆位点等元件。启动子是控制基因表达的关键元件，它决定了基因在何时何地开始转录。终止子则负责终止转录过程。选择标记用于筛选含有表达载体的细胞，通常包括营养缺陷互补标记、抗生素抗性标记或食品级标记等。

(3) 将表达载体导入受体菌 : 这通常通过电穿孔法、化学转化法或接合法等方法实现。导入后，表达载体将整合到受体菌的染色体上或作为质粒存在。

乳酸乳球菌表达系统的实验步骤通常涉及多个环节，包括受体菌的准备、表达载体的构建、导入受体菌、筛选与鉴定等。以下是一个基于一般原则的乳酸乳球菌表达系统实验步骤概述：

1. 受体菌的准备

(1) 挑选受体菌: 选择适当的乳酸乳球菌菌株作为受体菌，如MG1363等。这些菌株通常具有清晰的遗传背景，易于操作和表达外源基因。

(2) 培养受体菌: 将受体菌接种于适当的培养基中(如MRS培养基)，在厌氧环境下(如30℃恒温培养箱)进行培养，直至达到对数生长期。

2. 表达载体的构建

(1) 选择载体: 根据实验需求选择适当的载体，如pMG36e等。载体通常包含启动子、终止子、选择标记和克隆位点等元件。

(2) 克隆外源基因: 将目标外源基因通过PCR扩增、酶切、连接等步骤克隆到载体上，形成重组质粒。

(3) 验证重组质粒: 通过PCR、测序等方法验证重组质粒是否正确构建，并确认外源基因已正确插入载体中。

3. 导入受体菌

(1) 制备感受态细胞: 将受体菌培养至对数生长期后，通过特定的方法(如冰浴、离心、重悬等)制备成感受态细胞。

(2) 导入重组质粒: 将重组质粒通过电穿孔法、化学转化法或接合法等方法导入感受态细胞中。

(3) 复苏细胞: 将导入重组质粒后的细胞在适当的培养基中进行复苏，以恢复细胞活性。

4. 筛选与鉴定

(1) 选择筛选条件: 根据载体上的选择标记(如红霉素抗性)选择适当的筛选条件。

(2) 筛选阳性克隆: 在筛选条件下培养细胞，筛选出含有重组质粒的阳性克隆。

(3) 鉴定阳性克隆: 通过PCR、测序等方法进一步验证阳性克隆中是否含有正确的外源基因，并确认其表达情况。

5. 表达与纯化(可选)

(1) 诱导表达: 在适当的条件下(如添加诱导物、调整pH值等)诱导外源基因的表达。

(2) 收集产物: 收集表达后的细胞或上清液，根据实验需求进行后续处理。

(3) 纯化产物: 通过适当的纯化方法(如离心、过滤、层析等)纯化表达产物，以用于后续的实验或应用