疫苗对于个人和社会的重要性，经历过新冠疫情的人都会深有感触。而佐剂在全球新冠疫苗研发竞赛的强力助推下，不但得到了世界各国研发和监管部门的广泛认可，而且鉴于其与疫苗的有效性和安全性息息相关，也逐渐进入公众视野。佐剂与疫苗就像佐料与美味佳肴，不同的是很多疫苗没有佐剂基本上无效，而没了佐料的美味佳肴营养尚在，仍可充饥健体。吃水不忘挖井人，本文就来聊一下佐剂的起源以及其中涉及的关键人物Gaston Ramon。Gaston于1886年9月30日出生于法国葡萄酒圣地勃艮第（Burgundy）的一个名叫Bellechaume的小村庄，这个小村庄位于巴黎的东南部。Gaston家境普通，父亲是一位面包师，在4岁时随全家搬到附近森斯镇（Sens），森斯镇位于法国约恩河（Yonne River）的东岸，农业发达。Gaston在镇上读完小学和中学，期间对动物和生物学产生了浓厚兴趣。于是中学毕业后，Gaston于1905年通过考试获得了巴黎附近一所著名兽医学校——Maisons-Alfort学校的入学资格。这所学校在当时已拥有百余年历史，现为法国国立兽医学院-Maisons-Alfort。由于当时服兵役，Gaston于1906年才入学，入学后主修化学和传染病，并于1910年毕业。这是Gaston一生中接受的唯一一次高等教育。但Maisons-Alfort兽医学校的历史沉淀和深厚基础还是为Gaston此后的职业生涯和诸多关键发现打下了重要根基，比如一丝不苟的实验记录、细致入微的现象观察和思辨能力。值得一提的是，Maisons-Alfort兽医学校的弗拉戈纳尔博物馆至今还保存着250多年来的各类兽医档案和各种生物标本，这在博物馆众多的法国也显得极为特别。对兽医解剖学和兽医发展历史感兴趣的小伙伴不妨去参观一下。Gaston从Maisons-Alfort兽医学校毕业后，进入了塞纳河兽医卫生服务部门工作，工作内容与其所学比较对口，主要是负责动物疾病监测和动物流行病控制，以及对市场、屠宰场和肉类安全进行卫生检查。用现在的话说就是一个公务员的差事。不过工作了几个月后，机缘巧合Gaston被人介绍给了巴斯德研究所第二任所长埃米尔·鲁克斯（Emile Roux）。鲁克斯自幼就是个天赋加勤奋型选手，是路易斯·巴斯德（Louis Pasteur，著名细菌学家，巴氏杀菌的发明者）的得力助手和挚友，与巴斯德一起在霍乱、炭疽，和狂犬病及其疫苗领域进行了许多开创性研究并发现了白喉毒素这一致病蛋白，在巴斯德去世后接任其所长职位。Gaston之前就对巴斯德和鲁克斯敬仰有加。鲁克斯先是聘请Gaston担任巴黎郊区Garches工厂治疗血清制备部门的副主任。巴斯德研究所自1887年成立至今一直是一个私立公益科研机构。所以，Gaston的这一工作变动等于是舍弃了铁饭碗，不过这为其后来的重大发现和学术研究提供了重要契机。Gaston当时的工作内容就是给马匹接种各种免疫原，取血而后分离血清，并检测血清的抗毒素效力，同时给马治病，保持其健康。最终收获的合格血清可以作为治疗疾病的商品出售，当时的明星产品是含有白喉毒素抗体和破伤风毒素抗体的血清，两者在当时分别被称之为白喉抗毒素和破伤风抗毒素。其中，白喉杆菌引起的小儿感染病死率在当时高达30%-50%，是19世纪欧洲儿童死亡的主要原因。这里简单说一下为啥不给人直接注射白喉毒素和破伤风毒素来预防这些疾病，而要使用接种了上述毒素的马匹的血清。原因很简单，白喉毒素和破伤风毒素直接注射进入人体会产生较大的副作用，剂量把控不好甚至是致命的。其实，当时在治疗和预防性血清的商业化生产过程中，为了确保马匹安全，给马接种的也是毒素和抗毒素复合物。还有一个就是：为什么从马获取血清，而不是牛、猪和兔子等其他动物。原因可分为两个方面，第一：马与牛和猪相比具有更低的病毒/病菌感染可能性，通俗讲就是更干净；第二：马体型大，单次获取血清量较多，寿命长，而且性情较为温顺。马匹作为商业化血清工厂整体上更加廉价易行。1914年，第一次世界大战爆发，作为协约国的法国主要对战德国。随着敌人逼近巴黎，Gaston将血清制备部门转移到法国南部的图卢兹。此时的Gaston压力倍增，他一方面要满足平民在白喉抗毒素等方面的需求，同时还要满足军队对诸如破伤风抗毒素和抗坏疽血清等诸多预防和治疗血清的巨大需求。1915年，为了延长治疗血清的长期保存时间，Gaston受兽医学院期间了解到的甲醛可以延长牛奶保存时间的启发，开始将少量甲醛引入治疗血清，并取得了成功。1917年，31岁的Gaston与鲁克斯所长的侄孙女Marthe Moment结婚。随着战争的结束，Gaston开始将其心中参与科学研究的志向付诸行动。他萌生科研兴趣的主要原因源自其10年工作期间一丝不苟的生产记录、仔细观察、其他科研人员的相关报道以及由此产生的各种思考和猜想。想要验证这些思考和猜想的冲动让Gaston跃跃欲试。虽然在别人看来，这多少有些不务正业。1920年，Gaston终于获得鲁克斯许可在Garches建立了一个只有几平方米的小实验室开展自己的研究。没有人会想到，正是在这里Gaston做出了一系列令其载入史册的发现。值得一提的是，Gaston开展研究的同时，并未耽误其原有的本职工作，并于1926年全权接管了Garches血清制备厂的管理，直至1944年二战末期被纳粹清洗委员会解职。Gaston在制备血清过程中经常需要测定血清中的抗毒素含量。当时普遍采用的办法是德国科学家保罗·埃尔利希（Paul Ehrlich）发明的动物活体效价评价方法，即将毒素和马匹免疫后的相应血清以不同比例给豚鼠或小鼠注射，通过观察动物死亡多少来进行血清抗毒含量的标定。在实际的操作过程中，毒素和马匹免疫后的相应血清以一定比例混合后会产生絮凝，这种现象早在1909年就有过报道，但人们并不清楚絮凝产生的具体机制，其本质其实是抗原抗体复合物的形成过程。Gaston发现絮凝现象的明显程度与毒素和血清中抗毒素的含量（或抗毒能力）呈正相关，而且两者含量越高絮凝发生的越快，进而明确提出：絮凝首先出现在血清和毒素被完全中和的混合物中。这一发现也意味着，可以在体外用已知含量的毒素去滴定相应血清，并以此来定量抗毒素的含量，而无需借助繁杂耗时的动物实验来进行标定。1922年，Gaston公开发表了题为“白喉毒素和抗毒素的中性混合物”的论文。这篇文章为Gaston赢得了国际声誉，并在后来成为了体外定量抗毒素的重要基础，随后进一步拓展到体外抗体滴度检测、体外过敏以及免疫诊断和蛋白功能活性研究等多个方面。回顾Gaston的上述发现，不能看出这些主要得益于其在实际工作中对于“毒素和血清比例——絮凝——动物实验所得血清效价和抗毒能力”三方面的记录以及对三者之间相关性的思考。Gaston的另一项重要贡献是类毒素的发现。这其实源于其研究絮凝反应过程中为避免污染而做的各种尝试。当时的白喉和破伤风毒素主要来自于不同温度条件下的肉汤培养基。为了避免污染，提高实验结果的可靠性，1923年Gaston再次凭借其在兽医学院学习时少量甲醛即可确保牛奶不变质的启发，开始向肉汤培养物中加入甲醛。随后，他发现39度条件下被甲醛处理一个月的肉汤中获得的白喉毒素的毒性降低了，但仍然可以和相应血清中抗体形成絮凝产物，这也就意味着由此获得的毒素并没有失去抗体结合能力。在进一步的研究中，Gaston将甲醛和加热温度优化结合，完全消除了毒素的毒性，但仍保留了毒素与血清中抗体的结合能力，而且所得的无毒毒素同样可以在动物体内诱导产生抗毒素，类毒素由此诞生了！甲醛在适当加热条件下的毒素灭活机制是甲醛通过化学反应使毒素蛋白侧链基团之间发生交联并由此封闭或改变原有毒素蛋白的毒性位点，但并不显著影响毒素蛋白其他结构，包括可诱导产生相应抗体的表位。其实，在Gaston之前，已有众多科研人员进行了各种尝试想减弱或消除白喉毒素和破伤风毒素的毒性，包括加碘、三氯化碘或含有甲醛的水溶液即福尔马林等，但并不成功或实用。为此，有人提出通过注射毒素与抗毒素的混合物来一定程度削弱毒素带来的系列副反应和致病性。而Gaston的上述重大发现意味着向人体直接注射类毒素即可避免副反应和致病性，而且仍保留其诱导产生抗毒素的能力，即抗原性。1923年12月，Gaston在Academie des Sciences上发表了题为“关于白喉毒素的絮凝能力和免疫特性”的论文，并指出“给动物注射白喉类毒素本身只发现局部短暂的发红，没有其他副反应。”这为毒素向疫苗的跨越扫平了障碍。在此后的数年时间里，Gaston将上述类毒素制备方法拓展到包括破伤风在内的各种细菌毒素、植物毒素、动物毒素和病毒中，并证明了类毒素免疫获得抗毒素的方法是普遍适用的，这进一步巩固了其在免疫和疫苗领域的地位。其中值得一提的是，Gaston在1924年证明他所发明的方法在蛇毒灭活方面比单纯热处理或其他化学灭活方法更可靠。随后这种灭活的蛇毒被用于抗蛇毒血清的生产，Gaston将其称之为“anavenom”。时至今日，很多上市的灭活疫苗仍在借鉴Gaston的方法进行病原微生物的灭活和毒力消除处理。值得注意的是，1908年因抗体产生理论和活体动物抗体效价定量研究而获得诺贝尔生理学或医学奖的德国科学家保罗·埃尔利希（Paul Ehrlich）也曾提出类毒素（toxoid）概念，并认为toxoid已丧失诱导产生抗毒素的能力，即不具备免疫原性。而Gaston采用一种可广泛应用于商业化生产的模式制备出了类毒素（anatoxine），而且明确表明其兼具免疫原性和抗毒素结合能力。1913年Gaston在抗毒素生产过程中，就观察并记录了一个有趣的现象，即给马注射抗原毒素后，如果在局部注射部位形成脓肿并且局部炎症反应强烈的马匹会产生更高保护作用的抗毒素。其实，注射部位炎症反应和抗毒素含量高低之间关系的明确确证是在Gaston对抗原抗体复合物絮凝研究明白，并建立体外滴定法检测抗毒素含量之后。因为当时，无论是从经济成本还是可行性上来考虑，不可能对每一匹马收集到的血清都采用德国科学家保罗发明的动物活体效价评价方法检测。通用做法是将很多匹马采集而来的血清混合在一起，并累积到一定体积后再一起进行检测。所以，Gaston等于是为发现佐剂自己建造了一把恰逢其时的天梯。借助这把梯子，Gaston顺利验证了自己的推测，即动物产生抗毒素即抗体的能力与注射部位产生的局部炎症密切相关。他随后发现注射部位脓肿不是产生高含量抗毒素的必要条件，只要有适度局部炎症反应发生即可。1925年，Gaston发表了题为“免疫、抗毒素和抗毒素的生产”的论文。接下来，Gaston开始将研究重心转移到如何在注射部位诱发产生炎症反应，并在随后数年时间中尝试注射了各种物质，包括来自另一只马的注射部位脓液或细菌、不溶性血清、氯化钙、琼脂、甘油、明胶、面包屑、糊粉、土豆淀粉、牛奶、卵磷脂、胶乳、羊毛脂、胆固醇、凡士林、甲氧基、鞣酸、果胶等。这些物质中的很大一部分都源自于食物，这与其父亲身为面包师的职业息息相关。一是可以食用的东西通常较为安全，另外很多食品原料本身就有一定的纯度保障。值得一提的是，Gaston尝试的上述部分物质在提升抗毒素即抗体滴度方面优势并不明显，其中表现较好的是木薯淀粉。他将有作用的物质命名为“adjuvant”，并明确了其定义：一种特殊的惰性物质，当与特定的疫苗抗原一起注射时，或多或少地增加后者能够产生的免疫力。此外，限于当时技术发展和对免疫系统认知的限制，更加深入的机制并未被揭示证实。尽管如此，Gaston对佐剂的定义，以及向抗原中加入特定物质以便提高抗体滴度的明确理念，在后来的疫苗开发中逐渐成为人们的共识，经验性疫苗佐剂的时代也随之开启。此外，在现代免疫学建立之后，Gaston之前尝试过的诸多物质及其相关物质受到了众多科研人员的重新审视，为后续多种新型佐剂分子的发现提供了重要线索。Gaston在验证多种物质佐剂效力的过程中产生了一个想法：一种抗原是否可以作为另外一种抗原的佐剂使用。在他看来，多种抗原的组合符合其提出的佐剂理念。不过，当时免疫领域的主流共识认为，多种抗原注射会导致“多抗原竞争”，即多种抗原的混合会降低机体针对单个抗原产生免疫反应的能力。为了确证自己的想法，Gaston于1926年开始尝试将多种抗原组合在一起进行注射，首当其冲的尝试是白喉类毒素/破伤风类毒素与抗伤寒和副伤寒的灭活疫苗的组合。Gaston评价了抗伤寒和副伤寒的灭活疫苗对类毒素免疫反应的影响。结果表明，动物体内产生的类毒素免疫反应与木薯粉佐剂与类毒素的组合是相当的。后续还包括白喉-破伤风类毒素的联合，这一组合即是后来百白破疫苗的雏形。基于大量数据，Gaston明确指出，多种抗原同时注射后，动物体内产生的针对一种抗原的免疫反应并不会受到另外一种抗原的影响，甚至在某些情况下可以达到单独抗原与佐剂组合类似的效果。为此，“多抗原竞争”的观点逐渐被摈弃。Gaston源于佐剂理念的多抗原联合疫苗为后续多种联合疫苗的开发和应用奠定了极为重要的基础。当今使用非常普遍的多抗原联合疫苗包括：百白破疫苗、百白破-Hib-IPV五联疫苗、麻腮风疫苗、A/C群流脑疫苗、四价流脑疫苗、甲肝乙肝联合疫苗等。随着Gaston上述重大发现和开创性研究在领域内被逐渐认可，荣誉随之而来，但也并非一帆风顺。1933年鲁克斯去世，路易斯·马丁（Louis Martin）成为巴斯德第三任所长，Gaston升任为副所长。1934年Gaston几乎全票当选为法国医学院院士。1938年声势浩大的反白喉类毒素疫苗接种运动直指Gaston发明的白喉类毒素杀死了接种的儿童。幸运的是，专业人士和疫苗生产商提供了巨大支持，并帮其恢复了信心。1940年，Gaston接替退休的路易斯·马丁成为巴斯德历史上第四任所长。不过，6个月后，因其提出的财务和行政改革被董事会否决，他辞任所长职务，重新回到Garches工厂领导血清和疫苗的生产。1940年6月，二战中的德军占领巴黎，Gaston所领导的Garches工厂被迫开始为纳粹德军提供血清制品。1943年Gaston当选为法国科学院院士。1944年，二战末期德国纳粹清洗委员会开始清除巴斯德研究所被判通敌罪的研究人员，Gaston由于此前向德军提供血清制品而被释放，但解除了其对Garches血清和疫苗工厂的管理职务。二战结束后，Gaston于1947年被任命为法国国家卫生研究所研究主任。1948年离开巴斯德研究所，并于次年被40国代表推选为国际动物流行病办公室主任。他在那里发起并领导了一系列抗击口蹄疫、结核病、狂犬病和多发性硬化症的研究。1956年，他被授予法国荣誉军团大十字勋章，1959年退休。1962年冬天，Gaston因呼吸困难叠加豚鼠过敏，健康逐渐恶化。1963年6月8日Gaston去世，享年77岁。和国人叶落归根的理念类似，Gaston最后被葬于其出生地Bellechaume。1965年，他生前接受教育的Maisons-Alfort学校在建校200周年之际为其树立了雕像，并用他的名字Ramon命名了学校的相关建筑。后来，为了纪念Gaston，法国的许多街道、学院、中学等都以他的名字命名。Gaston由于其在免疫和疫苗领域的突出贡献，在1930-1953年期间被具有诺奖提名资格的机构和个人共计提名155次。虽然最终并未获得诺奖，但并未影响世人对其贡献的认可。回顾Gaston的一生，其成就离不开他本人的兴趣、所接受的教育、严谨的工作态度以及个人的勤奋努力。或许更重要的是其一直秉持的正直、诚实、严谨和无私，这其实也是Gaston对巴斯德和鲁克斯敬仰有加的重要原因。张勇，沈阳药科大学与英国东安格利亚大学联合培养药剂学博士，吉林大学生物学博士后。现为吉林大学生命科学学院副教授，专注疫苗佐剂基础研究和应用研究10年，发表SCI论文40余篇，一作和通讯作者论文20余篇，引用1400余次，H指数23，应邀参与编写中英文专著共4部。现为吉林省生物物理学会理事、东三省稽查药品认定专家库成员、中国疫苗行业协会核酸疫苗分会委员、中国疫苗行业协会细菌感染与疫苗研究专委会委员，受国家新药审评中心邀请参与我国新冠核酸疫苗、首款非铝佐剂二价、三价和四价新冠疫苗等十余项新型疫苗品种临床和上市审评工作。1. Butler, D. Close but no Nobel: the scientists who never won. Nature (2016). doi:10.1038/nature.2016.207812. Jean-Philippe Chippaux. Gaston Ramon’s Big Four. Toxins (Basel). (2024). doi: 10.3390/toxins160100333. https://www.pasteur.fr4. https://www.drpetermoloney.com/biography/gaston-ramon?start=1
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