本文描述了武汉大学博士生发表在Nature Communications上的研究，该文章探讨了乳腺癌细胞和肝脏细胞之间通过外泌体（EV）以及代谢产物产生的Crosstalk。文章采用假设→验证→假设迭代的推进过程，最终发现乳腺癌细胞通过分泌含有miRNA的外泌体，抑制肝脏细胞中的胆固醇代谢相关基因的表达，促进了胆固醇代谢以及25-羟基胆固醇的产生。该过程可能通过促进肝脏中特殊的巨噬细胞库普弗细胞的M2极化，诱导了肿瘤细胞的肝肺转移。
研究采用假设→验证→假设迭代的科学方法推进，提出并验证了乳腺癌细胞通过外泌体中的miRNA影响肝脏细胞胆固醇合成的假设。
研究通过多次假设迭代，逐步深入探索了miRNA、ATF、CH25H、25-羟基胆固醇以及库普弗细胞之间的关系。
虽然研究有一定的疏漏，但文章对假设迭代在科研中的应用提供了直观的认识，未来可以通过更多细致的验证使研究更加完善。
文章最终揭示了乳腺癌细胞通过外泌体中的miRNA影响肝脏细胞胆固醇合成及肿瘤肝肺转移的机理，为未来的研究提供了新视角。
miRNA和外泌体没落了么？其实也没有，因为miRNA和外泌体经常和细胞间的Crosstalk相挂钩，所以的确也会出现在一些高分文章中。今天讲的这篇文章就是武汉大学的博士生发表在14.7分的Nature Communications上的文章，这篇文章讲的就是乳腺癌细胞和肝脏细胞之间通过EV（细胞外囊泡，也就是外泌体）以及代谢产物，产生了Crosstalk。文章推进的过程，还是挺有意思的，因为这篇文章的推进，都是基于假设→验证→假设迭代这样一个过程（假设和假设的迭代，是一篇优秀的文章推进的基础，只有是通过假设迭代的在验证，才能逐步拨开迷雾，得出最后的结果，不清楚假设和假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《信号通路是什么鬼？》系列）。我们就一起来看看，他们的假设和假设迭代的过程都是怎么样的吧：
一般来说肿瘤与组织细胞之间的Crosstalk，会通过外泌体也就是EV来进行传递，而肿瘤细胞产生的外泌体会携带着一些信息。于是他们就提出了第一个假设，假设乳腺癌衍生出来的EV，会影响组织细胞产生一定的变化（假设就是基于已知信息而提出的，现在已知的信息是肿瘤细胞可能会产生EV，而这些EV也可能对组织细胞产生影响，于是就提出了这样的假设，而这个假设也是可以证伪的，不清楚假设提出和可证伪命题的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）。通过二代测序，分析差异基因，并进行富集后他们发现，EV会影响胆固醇合成。而胆固醇合成主要是在肝脏中，于是他们进行了乳腺癌EV处理后的肝脏样本分析，确定了乳腺癌EV对于肝脏的胆固醇合成的影响：
那么既然EV会影响肝脏细胞中胆固醇的合成，也就是说EV内容的物质中有可以诱导肝脏细胞胆固醇合成的组分。通过对乳腺癌EV的miRNA分析后，他们找到了一个miRNA，这个miRNA在EV中高表达，同时这个miRNA的靶基因正好与胆固醇合成有关。于是他们就进行了假设的迭代：假设这个乳腺癌EV中高表达的miRNA，就是调控肝脏细胞胆固醇合成的关键。而验证的过程，他们是采用了柯霍氏法则的验证方法，就是在普通的乳腺细胞中过表达该miRNA，或者抑制乳腺癌细胞中的miRNA产生，然后再用提取的EV处理肝脏细胞，查看表型（柯霍氏法则的验证，就是通过移除或移入关键因素，查看对于下游表型的影响，这里的关键因素就是miRNA，不清楚柯霍氏法则的话，可以去看看《轻松的文献导读》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）。结果表明乳腺癌EV中的这个miRNA就是调控肝脏细胞胆固醇合成的关键：
同时他们发现肝脏细胞在受到了乳腺癌EV刺激后，胆固醇合成的衍生物氧甾醇也会产生变化。而巧的是这个miRNA的靶基因，正巧有一个氧甾醇之一的25-羟基胆固醇有关。于是他们的假设又进行了迭代，也就是该miRNA可能通过调控靶基因ATF，影响25-羟基胆固醇的合成。于是他们分析了miRNA和ATF的结合，并分析了乳腺癌EV对于肝脏细胞中ATF的影响：
他们发现敲除了miRNA之后，并不会影响肿瘤的增殖。但会影响乳腺癌细胞的肝、肺转移。于是他们提出了这么一个假设，这个假设还是挺大胆的，就是假设肝脏中合成的25-羟基胆固醇，可能就是诱导肿瘤细胞肝转移的关键。那要怎么验证呢？他们就抑制了乳腺癌的EV的产生，并给小鼠注射了25-羟基胆固醇，来查看肿瘤的转移情况（这个验证可以说明乳腺癌EV的miRNA是通过产生25-羟基胆固醇影响了肿瘤的转移么？当然欠妥咯！为啥呢？因为这里并没有吧miRNA和羟基胆固醇的直接联系建立起来，两个命题的外延不同，实际上通过这样的验证，就会造成肯定后件的逻辑谬误，更妥当的验证，是应该通过突变ATF的3'UTR上的miRNA结合位点，然后再查看增加miRNA表达后的肝肺转移变化的，不清楚命题外延和肯定后件逻辑谬误的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼?》系列）：
那么miRNA-ATF，再到25-羟基胆固醇之间，还应该有一个环节，这个环节就是ATF的下游，25-羟基胆固醇合成的上游。他们找到了CH25H这个参与25-羟基胆固醇合成的基因。为了明确其功能，就对CH25H进行了敲减，而这个敲减，抑制了乳腺癌的肝肺转移（大家在这里可以思考一下，直接敲减CH25H，是否能证明miRNA→ATF→CH25H→25-羟基胆固醇→肿瘤的肝肺转移，要想明白这个问题，就需要分析清楚这里敲减CH25H产生表型的命题外延是什么，不清楚的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》中关于命题的那几章，清楚命题，才能更好地了解验证过程中可能产生的漏洞）：
造成肿瘤细胞的肝转移，与肝脏的微环境有密切的关系，肝脏中存在库普弗（Kupffer）细胞这样的特殊巨噬细胞。而库普弗细胞的极化情况，也与肿瘤的转移密切相关。于是他们迭代了新的假设，假设25-羟基胆固醇可以影响库普弗细胞的极化。通过验证发现，25-羟基胆固醇加入后，库普弗细胞产生了极化的偏移，明显偏向于M2极化形式，也就是产生了免疫抑制：
由于miRNA通过抑制靶基因，影响了25-羟基胆固醇的合成。那么在异种移植肿瘤后，过表达miRNA的靶基因，是否可以抑制肿瘤的肝转移情况，以及库普弗细胞的极化呢？（这里其实就是进一步的假设迭代，通过过表达靶基因来进行进一步的验证，假设的迭代其实也是推进课题的关键，不清楚假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《信号通路是什么鬼？》系列）。结果发现过表达miRNA的与胆固醇合成有关的靶基因，的确能抑制肿瘤的肝转移，并且抑制库普弗细胞的M2极化：
那既然过表达miRNA的靶基因可以达到这样的效果，倒推上去的话，抑制miRNA的表达是否也能对肿瘤的肝转移，及库普弗细胞的M2极化产生影响呢？他们通过miRNA拮抗剂和直接敲除miRNA进行了验证，结果也符合他们的预期：
接着，他们分析了临床数据，确定了该miRNA的表达与肿瘤的预后之间的关系（下面这个图我画得相当逼真了属于是，就是马葫芦，不对，是小提琴图，不清楚小提琴图的话，可以去看看《夏老师带你读文献》复习下）：
最后就形成了这样的示意图，乳腺癌细胞通过分泌含有miRNA的EV，抑制肝脏细胞中的胆固醇代谢相关基因的表达，促进了胆固醇代谢以及25-羟基胆固醇的产生。而25-羟基胆固醇通过促进肝脏中特殊的巨噬细胞库普弗细胞的M2极化，诱导了肿瘤细胞的肝肺转移，形成了这样的Crosstalk：
这篇文章看完，大家应该对假设迭代如何推进课题有了一个比较直观的认识了。但这篇文章在验证的过程中，还是有一定的疏漏的，如果针对miRNA能做一些靶基因3'UTR突变后表型变化的验证，这篇文章会更上一层楼。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话，可以看看原文，祝你们心明眼亮。
公众号回复“公克”，没事可以翻翻精华帖，里面有不少宝藏工具，当作是科研过程中的一种调剂也是不错的选择哦，科研并不一定要这么无聊又尴尬：
目前夏老师已正式出版11本书，想要的可直接点以下微店小程序直接购买：
