液相色谱串联质谱法检测试剂盒研究资料
审评关注点
内容提要：
随着液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）技术在临床应用领域的快速发展，该类检测试剂也成为研发和注册申报的热点。本文重点介绍了第二类液相色谱串联质谱法检测试剂的现状，对该类产品研究资料注册技术审评中的关注点进行了归纳，以期为企业在研发和申报注册该类产品时提供参考。
关键词：
液相色谱串联质谱；检测试剂；注册申报
Concerns of Research Document of LC-MS/MS Kit Registration
Abstract
：With the rapid development of liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology in the field of clinical application, mass spectrometry-based diagnostic reagents have gradually become the hot spot of research and registration.This paper mainly introduces the current status of the Class Ⅱ in vitro diagnostic reagent for the LC-MS/MS, and summarizes the concerns in the technical review of the research data registration of this kind of products, in order to provide reference for enterprises in the development and registration of this kind of products.
Key words
：Liquid chromatography-tandem mass spectrometry;Diagnostic reagents;Registration
近年来，液相色谱串联质谱技术（LC-MS/MS）已经成为体外诊断行业发展较快的检测技术之一。从检测原理来看，LC-MS/MS方法是一种将液相色谱和三重四极杆质谱联合起来的检测技术，它结合了液相色谱的高分离能力和质谱检测器对被测生物标志物质量的分析能力，是基于被测生物标志物的分子量、结构等化学性质的直接分析方法，因此具有高灵敏度、高特异性的特点。与传统生化免疫方法相比，LC-MS/MS更适合用于小分子被测物的定量检测，如维生素、药物及代谢物、激素等，在低浓度被测物检测和多组分联合检测中具有显著的优势[1-2]。
1 第二类液相色谱串联质谱法检测试剂盒产品概述
1.1技术原理
液相色谱串联质谱技术（LC-MS/MS）是采用高效液相色谱与两个串联的质量分析器相连接，待检测的临床样本在前处理后，通过液相色谱实现各组分的分离，分离的各组分顺序流入质谱仪。三重四极杆质谱仪是由两个四极杆质量分析器以及一个位于中间的碰撞室串联起来的分析仪器，首先离子源将被测组分进行电离，形成带电离子，由第一级质量分析器按照质核比筛选出母离子，母离子进入碰撞室，在碰撞室碎裂形成一系列碎片子离子，再由第二级质量分析器筛选出特异性强的子离子，每个母离子/子离子形成1个离子对，仅具有特定离子对的待测组分才能进入检测器，经过两次质量筛选和检测，实现待测组分的含量测定。因此，该方法具有较高的特异性。
液相色谱串联质谱技术能提供多种扫描功能和工作模式，其中多反应监测模式（MRM)是三重四极杆质谱仪定量分析检测最常用的方法，它具有灵敏度高、特异性强、重现性好以及分析速度快等优点。
LC-MS/MS技术在体外诊断领域的应用上，国内起步较晚但整体发展较快。截至2022年8月底，全国有26家体外诊断试剂企业的74个液相色谱串联质谱法试剂盒获得二类医疗器械注册证，相关企业主要分布在湖南、上海、江苏、山东、浙江等地。从注册证数量来看，2019年之前共有9个、2020年11个，2021年32个，2022年（截止8月底）22个相关方法学试剂盒获批，可以看出，从2020年开始该方法学检测试剂盒的获批数量呈现明显增长的趋势。
从产品类别来看，主要以维生素检测试剂（水溶性、脂溶性）、药物及药物代谢物检测试剂和激素检测试剂为主。其中维生素类检测试剂数量最多，占比46%，此类产品中又以25-羟基维生素D检测试剂为主，属于单组分检测试剂盒，也是较早获得注册的LC-MS/MS检测试剂品种之一，其临床应用较为成熟，被认为是维生素D检测的“金标准”[3]。近两年有多种脂溶性维生素及水溶性维生素检测试剂盒获批上市，产品逐渐向多组分联合检测的趋势发展；药物及药物代谢物检测试剂主要应用在免疫抑制剂类（如环孢霉素、他克莫司、雷帕霉素等）、抗癫痫药物、抗生素的检测，检测药物类型仍较少，相信随着个体化用药理念的普及和LC-MS/MS的应用发展，将来会有更多药物浓度检测产品注册上市；激素检测试剂主要是类固醇激素（如皮质醇等）的检测，已上市产品已经能够满足同时检测多种类固醇激素的需求。类固醇激素在血液中含量低、存在个体差异，进而对检测方法的灵敏度、特异性要求很高，因此在类固醇激素的检测中LC-MS/MS方法与免疫学方法相比具有一定的技术优势[4]。用于其他生理、生化指标检测的试剂主要有同型半胱氨酸、甘胆酸等检测试剂盒。
鉴于液相串联质谱技术在临床应用的快速发展，目前研发并申报该方法学第二类体外诊断试剂的生产企业越来越多，出于对本类产品临床使用安全有效性的考虑，本文结合该类产品的具体特性，从技术审评的角度，归纳其研究资料中安全性有效性评价的主要关注点，常见有以下几点（包括但不限于以下内容）。
产品名称应符合《体外诊断试剂注册与备案管理办法》（国家市场监督管理总局令第48号）[5]及相关法规的要求，具体应当遵循以下原则：产品名称一般由三部分组成，分别是被测物质的名称、用途（如测定试剂或检测试剂等）、方法或者原理（如液相色谱串联质谱法）。该方法学具有多组分检测的优势，如果被测物组分较多时，产品命名可以采用与产品相关的适应症名称或者其他替代名称。
在液相色谱串联质谱法体外诊断试剂设计开发过程中，选择稳定、可靠的试剂和主要原材料至关重要，主要原材料的选择和质量标准的确定在一定程度上影响着后续液相条件和质谱参数的建立，也是体外诊断试剂质量水平的重要决定因素。该系统的检测原理决定了其对使用的试剂和原材料质量纯度要求较高，主要原因是其中的杂质可能会导致离子抑制，进而影响离子化效率。申报资料应详细描述产品检测系统的各组成部分，包括但不限于样本处理用试剂、质控品、校准品、流动相、耗材等基本信息，及其在检测中发挥的作用。重点关注产品检测系统中流动相（含添加剂）、各前处理试剂的质量要求，LC-MS/MS方法在分析前一般需要对样本进行纯化或者浓缩，应根据申报产品所选择的前处理方法说明前处理试剂和耗材，如蛋白沉淀剂、衍生化试剂、复溶液等试剂，SPE柱、96孔板及硅胶盖垫等耗材。由于内源性物质干扰，校准品所用的基质和临床样本有差异时，产品研发中会选择加入内标物质，主要用于LC-MS/MS定量分析中校正基质效应或前处理、离子化过程中产生的偏差，此时建议申请人在申报资料中提交校准品/质控品基质、内标物质的名称、基本信息、来源、质量标准及选择浓度等信息，以供审评人员全面了解产品组成和原材料质量标准，技术审评需要时应提交主要原材料研究资料。
目前在临床应用上与传统的生化、免疫方法学产品相比较，LC-MS/MS前处理步骤复杂，是影响分析定量的关键因素之一。因此，研究资料中前处理方法是需要重点关注的环节。目前临床应用常见的样本前处理方法包括衍生化处理、蛋白沉淀、固相萃取、液相萃取等，产品的前处理方法可以是一种或多种方法的组合，如为了提高分析物的质谱灵敏度或改善分析物的色谱分离度等而采用的化学衍生处理，为了去除临床样本中大分子蛋白、基质而采用的蛋白沉淀法、固相萃取或液相萃取等，建议申请人在申报资料中明确前处理方法及提取率、相关试剂（含内标溶液）组成或浓度、加样量、加样顺序和反应条件等。技术审评需要时应提交反应体系研究资料。
2.4液相条件的优化
色谱柱、流动相均是影响被测物分离效果和检测准确性的关键因素，选择不同流动相和色谱柱能够实现不同的分离效果，因此，针对不同的被测物需要单独优化和建立检测参数。常用的色谱柱种类较多，有疏水性色谱柱（如C18）、亲水性色谱柱（如HILIC）等，申请人应明确选定的色谱柱品牌及特性参数，包括但不限于柱长度、内径、固定相等，并应考虑色谱柱使用寿命期限、保养和更换，建议在产品说明书中给出相关提示。申请人应当根据被测分析物的理化性质，进行流动相的优化，并在申报资料中明确流动相种类、组成及浓度、进样器清洗液组成和比例、流动相洗脱梯度、进样体积、流动相流速、保留时间等液相条件，同时应明确经验证的柱温箱温度。建议提供总离子流色谱图，如为多组分联合检测应提取每个被测分析物及相应内标物的色谱图，标注色谱峰的保留时间和对应分析物的名称。
质谱参数是影响液相串联质谱法检测试剂盒性能的关键因素，主要包括离子源参数，扫描参数及其离子对的选择。申请人应明确本产品的离子源种类、离子源参数、电离方式（正离子或负离子）、各电压与气体流量参数等参数设置，提供详细的被测物及相应内标物质的母离子/子离子对质核比，如在前处理过程中采用化学衍生化处理，此时应提供衍生后的离子对。技术审评有需要时，可提供被测物及内标物碎片离子扫描质谱图，如为多组分联合检测应分别提供每个被测分析物及相应内标物的碎片离子扫描质谱图，并标注母离子、子离子的质核比。
目前该类检测试剂均以定量试剂进行申报，申请人应依据《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》《定量检测体外诊断试剂分析性能评估注册审查指导原则》等对产品所需的常规性能指标进行评估，包括检出限和定量限、准确度、溯源性、精密度、线性范围、分析特异性等，值得关注的是，LC-MS/MS是由连续流路组成的一体式检测系统，系统内积存的干扰物或被测目标物都会造成携带污染，因此建议申请人对携带污染进行评估，以不影响检测结果的准确性或精密度。另外，基质效应的评估也是方法建立和验证中至关重要的环节，内源性物质或外源性物质都可能引起基质效应，进而影响产品的准确度和灵敏度[6]。具体可以参考国际上相关性能评价的技术文件，如美国临床实验室标准化协会（CLSI）发布的C62、C50-A文件[7-8]等，以及国内有关标准、指导原则和专家共识，对申报产品进行科学全面的评价，以满足临床应用要求。如申报产品为多组分检测试剂，应分别对每个组分进行性能验证。
对于已经列入免于临床试验体外诊断试剂目录的液相色谱串联质谱法检测试剂产品，申请人可参照《免于临床试验的体外诊断试剂临床评价技术指导原则》（国家药品监督管理局通告 2021 年第 74 号）的相关内容要求进行临床评价，并整理形成临床综述资料和临床评价报告等。未列入免于临床试验体外诊断试剂目录的液相色谱串联质谱法检测试剂产品，应通过临床试验的方式进行临床评价。申请人可根据试验目的，综合考虑待评价诊断试剂产品的预期用途、产品特征和预期风险等，制定合理的临床试验方案，并严格按照《医疗器械临床试验质量管理规范》《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》（国家药品监督管理局通告2021年第72号）、《体外诊断试剂临床试验数据递交注册审查指导原则》的要求正确递交临床试验方案、临床试验机构伦理委员会同意开展临床试验的书面意见、知情同意书样本、临床试验报告及临床试验数据库等临床评价资料。
对于多组分联合检测试剂，应针对每一种待测分析物分别进行样本量统计，同时应纳入一定数量的可能对检测产生干扰的样本，以评价产品检测的特异性。
液相色谱串联质谱法检测试剂产品说明书是体外诊断试剂注册申报资料中最重要的文件之一，其格式和内容应符合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》[9]的要求。此外，该类产品的说明书还应重点关注以下内容：（1）应详细说明该产品的前处理方式、检测原理及扫描模式，必要时可用图示说明；（2）化学品防护，产品主要组成成分中的流动相、前处理试剂和复溶液等可能含有乙腈、甲醇等有机溶剂或有机酸等其他化学品试剂，应给出有效防护措施及安全操作提示；（3）应明确检验中使用的内标溶液、前处理试剂的配制方式、保存条件等；（4）仪器准备、仪器使用相关参数、色谱柱参数及结果处理。
液相色谱串联质谱法体外诊断试剂的发展很快，产品日益增多，临床应用已经进入快速发展期。与相对成熟的生化免疫方法相比，液相色谱串联质谱法检测试剂在研发、注册和临床应用中还有不少挑战，主要表现在质谱检测方法操作相对复杂，涉及样本前处理方法的建立与优化、色谱条件/质谱条件的建立与优化、校准品和内标的选择等等一系列步骤，因此对人员能力要求比较高；样本前处理自动化程度低，检测通量也有待提高；针对性的国家或行业标准、指导原则等技术规范文件较少，对产品研发和注册申报指导不够；申报企业对产品注册的合规性不够，建议根据《体外诊断试剂注册与备案管理办法》等规章文件进行试剂盒整体注册，对产品分析性能、参考区间和临床评价等进行充分研究，以保证产品检测结果的稳定可靠。
随着液相色谱串联质谱仪器的逐渐国产化、样品前处理过程的自动化，以及整个体外诊断试剂行业对质谱技术的了解和技术的进一步发展，相信在不久的将来，该方法检测试剂盒能覆盖的检测项目会越来越多，审评部门对该类产品的技术审评要求也在不断完善中。
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[3] 韩丽乔，张乔轩，黄宪章，液相色谱串联质谱技术定量检测的临床应用现状与挑战[J].中华检验医学杂志,2020,43(10):945-950.
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[5]国家市场监督管理总局.体外诊断试剂注册与备案管理办法[EB/OL].(2021-08-26) [2022-09-25].
https://gkml.samr.gov.cn/nsjg/fgs/202108/t20210831_334232.html.
[6] 曹志民,周伟燕.临床质谱实验室自建方法的常见问题和对策分析[J].中华检验医学杂志, 2020,43(12):1160-1165.
[7] Clinical and Laboratory Standards Institute. Liquid chromatography-mass spectrometry methods. CLSI document C62，CLSI, 2022.
[8] Clinical and Laboratory Standards Institute. Mass spectrometry in the clinical laboratory：general principles and guidance; approved guideline. CLSI document C50-A, CLSI, 2007.
[9]国家食品药品监督管理总局.体外诊断试剂说明书编写指导原则[EB/OL].(2014-09-11)[2022-09-25].https://www.nmpa.gov.cn/xxgk/ggtg/ypshmshxdgg/20140911120001673.html.
来源：《中国医疗器械信息》2023年第5期
