浅谈设计ADC药物的要素

ADC 是一类新的抗癌药物，它把抗体的特异性和高效能的小分子毒素通过连接区偶联起来，成为了一个同时具备两个特性的新分子。迄今为止已有两个ADC药物被美国FDA和欧盟EMA获批： 由Seattle Genetics 自主研发的 Brentuximab Vedotin （aCD30-vc-pAB-MMAE）在2011年被批准用来治疗 anaplastic large cell lymphoma (ALCL) 和 Hodgkin lymphoma (HL). 另一个是 Roche自主研发的 Trastuzumab Emtansine (T-DM1) 在2013 年被批准用来治疗 Her2 阳性的乳腺癌。自从2013年ADC领域迅猛发展，现在有60多个ADC 药物正在进行临床试验用来治疗多种癌症，希望不久的将来有更多的ADC 药物被批准。

化疗属于最经典的肿瘤治疗手段，但众所周知毒副作用非常大。针对于肿瘤表面高表达的抗原，ADC可以把更高效能的毒素带到肿瘤细胞从而有效杀伤肿瘤组织，大大降低对其它正常组织的影响。因此ADC可以逐渐取代化疗达到特异性杀伤肿瘤的疗效。化疗不仅毒副作用大，它还显著抑制人体的系统免疫功能。ADC起到局部杀伤肿瘤, 特别是有些类毒素 (Tubulysin and PBD) 还可以引起 immunogenic cell death，激活dendritic cells 活性，从而提高免疫系统功能。由此可见ADC和免疫 checkpoint inhibitor 合用会产生更好的抗肿瘤治疗效果。现在有不少这样的临床试验正在进行中。

图1: ADC作用机制

ADC 在血液循环里保持稳定，只有通过抗体结合到肿瘤靶点才会释放携带的毒素到肿瘤细胞。 ADC 首先通过特异性抗体结合肿瘤表面抗原，然后整个抗原抗体复合物一起进行endocytosis（细胞内吞作用）， 先到 endosome（核内体）， 然后到lysosome （溶酶体）。 在溶酶体内毒素被从ADC中释放，最后毒素进入到细胞质，导致细胞死亡。还有一种情况，如果ADC在肿瘤微环境里不太稳定，毒素会在细胞外释放，然后穿过细胞膜进入肿瘤细胞内引起细胞死亡。

图2: ADC组成成分

ADC 包括三部份： 1）针对肿瘤表面抗原产生的抗体(Tumor Antigen antibody)； 2） 杀肿瘤的毒素(Toxin payload)；3）连接抗体和毒素的连接区 (Linker)。 下面对每个组成成份进行详细说明。

1）肿瘤表面抗原和特异性抗体的选择 (Tumor Antigen and antibody)： ADC最理想的肿瘤靶点应该只在肿瘤表达但不在正常细胞组织表达。但是肿瘤细胞是从正常细胞突变过来的， 所以这种理想化的肿瘤靶点是很难找到的。在实际应用中只要选的ADC靶点在肿瘤中的表达远远超过正常组织，这样通过抗体结合肿瘤表面抗原，ADC就会选择性的把毒素带到肿瘤 。对抗体的选择包括抗体要有较高的亲和力（high affinity）；有较强的特异性(high specificity)；抗体应该用人源化（humanized）或全人 (human) 抗体；ADC中的抗体成份还应该有较强的内吞功能 （internalization）因而有效携带毒素进入肿瘤细胞内部，然后转运到溶酶体（lysosome）从而有效释放毒素杀伤肿瘤细胞。

2）杀肿瘤的毒素(Toxin payload)：ADC用的毒素主要分两大类，第一类是微管抑制剂（anti-microtubule agents）包括 maytansinoids (DM1) 和 auristatin (MMAE, MMAF)。微管毒素主要抑制快速生长分裂的细胞，所以对肿瘤细胞有一定的特异性。目前通过的ADC药物Trastuzumab Emtansine (T-DM1) 用的是前者；Brentuximab Vedotin    用的是后者。还有在临床试验中的ADC大多使用的是这类毒素。  

第二类是DNA抑制剂 （DNA damage agents）包括 烷基化试剂 （Alkylating agents such as Duocarmycin）; 抗生素用来产生DNA双螺旋断裂（the enediyne antibiotics including calicheamicin）; 结合DNA 小沟的制剂 （pyrolobenodiazepine，(PBD)）。DNA毒素效力超级强, (IC50 在 picomole 范围), 主要抑制DNA复制转录修复功能，所以对所有细胞都有杀伤功能。因此当ADC用DNA毒素杀肿瘤，尽管它的功效非常好，它的毒副作用也比较严重。Seattle Genetics 最近宣布 停止Vadastuximab Talirine （SGN-CD33A） 三期 临床试验，由于用药病人出现了较高的死亡率。SGN-CD33A 使用的是PBD毒素，所以DNA抑制剂这类毒素的安全性还有待于更多临床试验的证实。

3）连接抗体和毒素的连接区 (Linker)：设计连接区的几个要点， 第一 要在血液循环中稳定，确保没有毒素的释放； 第二 当ADC 进入肿瘤细胞，毒素要被有效释放；第三 要尽量设计亲水性的连接区，以避免ADC 聚合物的形成。ADC 聚合物被肝清除的时候不但容易引起肝毒性(hepatotoxicity), 而且还容易引起免疫原性  (immunogenicity)。亲水基团（hydrophilic moiety）包括 sulfonate groups，polyethylene glycol (PEG) group，或者pyrophosphate diester groups 已经用来加在连接区来提高整个ADC 的亲水性。四种连接区设计已经出线在临床试验中，腙（hydrazones）依靠酸性环境释放药物； 二硫化物（disulfides）依靠还原的巯基释放药物；组织蛋白可切的双肽 （cathepsin B cleavable dipeptides）依靠酶切释放药物; 和不可切的（noncleavable）依靠抗体降解释放药物。比如 Brentuximab Vedotin （aCD30-vc-pAB-MMAE）主要是通过溶酶体组织蛋白酶切断 VC 双肽连接区从而释放MMAE。Trastuzumab Emtansine （aHer2-MCC-DM1）是通过ADC在溶酶体降解释放Lysine-MCC-DM1. 

图3: ADC 偶联 （Conjugation）方法：A， Lysine偶联产生零到八个DAR，每个抗体有四十个左右的Lysine可以被偶联。B，Cysteine偶联产生0，2，4，6，8 个DAR，每个抗体有八个在铰链区的Cysteine可以被偶联。C，定点偶联利用抗体上的一个特异位点突变产生Cysteine 用来做偶联反应，每个抗体有两个DAR。

随机偶联 （random Lysine or Cysteine conjugation）

Lysine Amide 偶联： 抗体表面lysine 能和 linker 区 N-hydroxysuccinimide （NHS）起反应。抗体序列有80 个左右lysine，大约10 个能够用做偶联反应。所以偶联反应的产物是一个混合物，包括不一样的Drug Antibody Ratio (DAR) 和不一样的偶联位点。在T－DM1，平均DAR是3.5 到4，包括从0到7 的分布。DAR和它的分布显著影响ADC PK/PD；抗体可变区 lysine 一旦被修饰，会影响抗体结和抗原的亲和力。FDA通过的ADC药物 Trastuzumab Emtansine (T-DM1)就是用的这种偶联方法。

Cysteine偶联:  抗体Cysteine 和 linker 区能与巯基反应的功能基团 (Maleimide) 起反应。 一般来说，抗体表面没有自由巯基，所有Cysteine 来自二硫键。最常见的ADC isotype 是人IgG1, 它包括四个 interchain 和 十二个 intrachain 二硫键。其中四个 interchain 二硫键 对人IgG1结构影响不大, 所以在比较温和的条件下被还原成二，四，六，八 个自由巯基。这种方法最多有八个偶联位点，比起Lysine 的八十个位点，更具选择性。FDA通过的另一个ADC药物 Brentuximab Vedotin 就是用的这种偶联方法。

通过Lysine or Cysteine化学偶联，最终产物是混合物，包括不一样的Drug Antibody Ratio (DAR) 和不一样的偶联位点。这种混合物导致较差PK，较少的肿瘤分布，更多的毒副作用，较窄的治疗空间。此外，分析鉴定和控制生产批量之间的差异性也是技术上的大难题。为了克服这些难题，定点偶联（site specific conjugation）技术随之出现。

定点偶联 （site specific conjugation）

Engineered cysteine: Genentech 发明了THIOMAB 技术，利用抗体上的特异位点突变产生Cysteine 用来做偶联反应，避免了破坏抗体自身的interchain 二硫键。这个技术的最终产物 是DAR＝2 在抗体同一 位点的 抗体偶联物，它具有与常规ADC同样的体外体内活性，但是在大鼠和猴子的毒副作用显著降低，因而提高了ADC治疗空间。选择抗体哪个位点变成Cysteine至关重要。当cysteine被置换到抗体轻链（light chain，LC）, 重链（heavy chain，HC）, 或者 恒定区 （Fc region），每个ADC PK 和 疗效 均有显著差别。这说明抗体局布理化特性决定了ADC位点的稳定性。

Engineered non-natural amino acids (nnAAs)：改造遗传代码产生新的带有反应基团的非自然氨基酸，例如selenocysteine 和 acetylphenylalanine (pAcPhe)。 Selenocystein 方法已被用于产生 Her2 ADC。在Her2抗体 重链A114 （同一位点已用于 THIOMAB），UGA amber stop Condon 被引入。Her2抗体114位点 acetylphenylalanine (pAcPhe) 在CHO 细胞系中表达，linker 含MMAF毒素 被偶联到 Her2抗体此位点。这种特异位点ADC在血液循环中保持稳定，当到达肿瘤具有特异性杀伤肿瘤能力。

Transglutaminase (TG)：Microbial transglutaminase (mTG) 催化 glutamine 上的 胺基 (amine) 和 lysine 上的 胺基 (amine) 形成 异肽键 （isopeptide bond），同时释放尿素。mTG 也可催化抗体序列中特异 glutamine （Q）进行偶联反应形成 同质的ADC。mTG不能识别在糖基化抗体 恒定 （Fc）区的glutamine， 但是当抗体通过peptide-N-glycosidase F (PGNase F) 在N297 位点去糖基，Q295 就能被mTG催化，形成携带两个药物 （DAR＝2）的ADC。还有一种情况，当N297Q 突变产生额外两个Q 位点用作偶联反应，这样就可以形成携带四个药物 （DAR＝4）的ADC。除了Fc区天然Q位点，Strop 和同事 用 LLQG （glutamine tag）这四个氨基酸序列 作为mTG催化底物，然后把LLQG 插在理想的抗体位点进行偶联反应。

Sortase：金黄色葡萄球菌中 Sortase A 能催化LPXTG氨基酸序列，切掉 threonine-glycine (T-G) bond， 接上含有oligoglycin (oligo-G)的序列。LPXTG序列可以被整合到抗体的不同位点进行偶联反应。生物素化 class I MHC 限制的多肽被 Sortase A 偶联到带有LPETG-His6 标签的aDEC25 抗体重链。这个偶联物内吞到 DC细胞, 然后表面递呈MHC限制的多肽 从而进一步激活T细胞功能。另外Beerli 小组发现LPETG序列首先被加到不同的抗体重链或轻链C末端，带有penta-G的毒素MMAE 通过 Sortase A 偶联到抗体上。这样产生的ADC具有和FDA通过的两个ADC药物 （brentuximab vedotin，trastuzumab emtansine ）相似的体外体内肿瘤杀伤能力。

N-Glycan engineering: N297位点是抗体恒定区的N－糖基化经典位点。聚糖是很好的偶联位点，因其远离抗原结和位点和不太影响抗体PK。SynAffix 描述了三步方法用聚糖合成带有确定DAR的ADC。第一步，抗体通过endoglycosidase Endo S 切除N端聚糖，只剩下GlcNAc；第二步，Y289L突变的bovine β(1-4)-galactosyltransferase 用来转运含叠氮（Azido）的糖到抗体；第三步，通过click 化学反应 drug－linker (药物－联接区)被偶联到抗体，产生DAR=2 的ADC。Zhou 的小组描述了另一种方法：抗体经过β(1-4)-galactosyltransferase and α(2-6)-sialyltransferase 首先被 sialyated，接下来在温和条件下过高碘酸盐氧化，含醛的抗体通过肟化学反应被偶联。采用这种方法，aHer2 抗体 (trastuzumab) 被偶联产生ADC 带有 DAR 接近 2。 

在众多的定点偶联方法中，哪一种最好现在还很难定论，除非做一个头对头的临床试验。另一方面从生产的角度来评价，哪一种方法成本低质量稳定也是一个重要的因素。然而不管怎样，定点偶联技术迟早是要取代通过Lysine或cysteine得到的非定点偶联技术。这样技术上的革新会大大提高ADC PK；因而显著降低给肿瘤病人ADC剂量。这样在不影响 ADC临床疗效的同时大大降低毒副作用。

表1: 已被FDA通过的ADCs和正在做 三期临床试验的ADCs

目前的ADC技术还有望在以下方面继续提高。

1）偶联技术: 定点偶联肯定会取代当前随机Lysine 或Cysteine 偶联技术。这样不但便于定量检测分析，还有利于提高PK 增加ADC治疗窗口。

2）毒素的选择: 从当前采用最多的微管抑制剂（DM1，MMAE，MMAF）到毒性更强的DNA抑制剂 PBD, 例如Rova-T from Stemcentirc 和 SGN-CD33A from Seattle Genetics. IMMU-132 from Immunomedics 则采用化疗药物irinotecan 代谢活性物SN-38 做为毒素，通过连接区SN-38被偶联到Trop2 抗体上用于治疗乳腺癌和肺癌，现在此ADC正在临床试验二期中。此ADC可以带有8个SN-38以达到治疗功效。

3）连接区（Linker）的多样性：现在常用的连接区包括不可切的和可切的。Trastuzumab Emtansine (aHer2-MCC-DM1) 属于前者，这类连接区在血液循环中稳定，只有ADC抗体结合肿瘤细胞表面抗原，在被肿瘤细胞内吞后，整个分子在溶酶体被降解后，毒素才得以释放。Brentuximab Vedotin （aCD30-vc-pAB-MMAE）属于后者，被组织蛋白切的vc-pAB连接区现在应用比较广泛，许多临床试验阶段的ADC都采用这个连接区。最近Mersana 发明了一种叫Fleximer 平台：一个不可切的连接区用来连接Fleximer和抗体；另一个可切的连接区用来连接毒素和Flexime。在这种设计下一个ADC可以携带12到15个毒素，在不影响PK的情况下，很大增加了ADC的疗效。现在用这个技术做的Her2ADC 正在一期临床试验中，希望很快知道一些临床数据来证实它的优越性。

4）ADC抗体靶点的选择：当前人源或全人抗体技术相对比较成熟，寻找ADC新靶点是大家研发的重点。除了临床被证实的二个ADC靶点 Her2 和CD30, 我们可以继续跟踪其它新靶点的进展。有一点需要指出，有时候新ADC临床效果不太理想，并不一定是靶点不好，要分析整个分子，包括毒素，连接区，偶联方法。正如以上所述，ADC是一个复合分子，一定要考虑到每一个组成成分，这样才能最佳的设计好功效高副作用小的抗肿瘤药物。