原名： Metabolomics reveals a differential attitude in phytochemical profile of black tea ( Camellia Sinensis Var. assamica ) during processing

译名： 代谢组学揭示了红茶在加工过程中植物化学特征的差异

期刊： Food Chemistry:X

IF： 6.5

发表时间： 2024.10

通讯作者： 龚加顺，Shah Fahad

通讯作者单位： 云南农业大学食品学院，阿卜杜勒·瓦利汗大学马尔丹

1. 均匀设计和实验结果

本研究采用均匀设计U* ₁₅ （15 ⁷ ），通过不同的萎凋时间、发酵时间和发酵温度等方法制作红茶。在使用各种技术加工红茶后，茶艺专家对五个因素进行感官评估，包括 (a) 外观、 (b)香气 、(c)汤色 、(d)味道和 (e) 叶底，并根据每种制作方法评估结果（表 1）。因素范围如下：X1 (14-22h)、X2 (2-10h) 和 X3 (26-34℃)。

为确定参数的优化条件，我们进行了逐步多项式回归分析，考察萎凋时间（X1）、发酵时间（X2）、发酵温度（X3）对红茶感官品质（Y）的影响。DPS软件展示了得分“Y”与各种因素之间的多项式回归评估，回归方程如下：

从二次多项式回归分析可知，相关指标包括：方程的相关系数（R）、总体F统计量（F）值、显著性水平（ P 值）、残差标准差（S）、调整相关系数（Ra）和Durbin-Watson统计量（d）分别为：R = 0.9335、F = 5.0854、 P = 0.0314（ P < 0.05）、S = 1.1053、Ra = 0.8367和d = 2.6777。如果（ P < 0.05）Ra越接近1，Durbin-Watson统计量越接近2，则表明回归分析具有统计学显著性，从以上统计参数可以看出，该回归方程拟合得很好。根据Xu的理论，如果 R 值越接近 1，则预测值和实际值的相关性越强。在本研究中，相关系数 R = 0.9335 表明预测值和实验值之间具有很强的一致性。各因素观测值、拟合值与拟合误差的比较及相关性见表2a；表2b为二次多项式逐步回归分析的相关统计结果。

t检验值用于评价统计结果的可信度，t值越大，可信度越高。根据t检验值可知，各因素及其交互作用对均匀度的影响大小顺序为：X2X2 > X1X3 > X1X2 > X1 > X2 > X3X3 > X2*X3 > X3。从均匀设计结果得出的回归方程仅适用于所研究参数的指定范围内。分析结果表明该方程拟合良好。随后，为了求解回归方程，我们使用 DPS 软件 ，遵循前期Zhang所描述的方法，使用方程 (1)，确定了用于生产优化红茶的均匀设计的最佳参数，如表3所示。

优化后的红茶加工工艺为萎凋14小时，发酵5.6小时，温度为34℃。随后我们对样品进行综合分析，包括代谢组学、茶叶品质成分测定以及儿茶素、没食子酸、咖啡因和茶黄素等化合物的测定。

2.不同加工阶段代谢物的特征

2.1 红茶加工过程中挥发性化合物的 HS-SPME-GC-MS（化学计量分析）测定

为探究云抗10号红茶的独特风味及其与加工工艺的关系，我们采用GCMS-SPME萃取分离挥发性成分，在云抗10号红茶中共鉴定出157种挥发性成分，包括7种醛类、3种有机硫化合物、2种酚类、8种醇类、3种胺类、27种萜类、13种酯类、9种烃类、5种酮类、24种杂环化合物、2种醚类及其他成分52种。我们对各加工阶段中各组成分含量进行了比较分析，如图1所示。各组成分在不同加工阶段的含量均存在明显差异。

TIC 图（图 2a）显示了5个加工阶段（FTL：鲜茶叶、WL：萎凋叶、RL：揉捻叶、FL：发酵叶 和 DL：干燥叶）茶叶中挥发性化合物的差异，并揭示了5个阶段彼此不同，特别是 19 种挥发性化合物，包括 2-甲基丁醛、己醛、苯乙醛/苯基苯乙醛、芳樟醇、乙酸芳樟酯、3-蒈烯、(+)-4-蒈烯、芳樟醇氧化物 I、芳樟醇氧化物 II、香叶醇、己酸-3-乙烯酯、吲哚、丁酸-3-己烯酯、苯甲醛、水杨酸甲酯、苯甲醇、(2R)-2-羟基-3-甲基-丁腈和 3-异亚硝基-2,4-戊二酮。FTL 中发现的主要挥发性化合物是 2-甲基丁醛 (6.0 %)、己醛(b) (5.68 %)、芳樟醇（5.31 %）、3-蒈烯（24.53 %）、(+)-4-蒈烯（24.41 %）、芳樟醇氧化物（芳樟醇氧化物I、芳樟醇氧化物II和反式芳樟醇氧化物）（3.26 %）、香叶醇（6.47 %）、己酸叶醇酯（4.96 %）、吲哚（3.24 %）、丁酸3-己烯酯（2.65 %）、苯甲醛（0.49 %）、水杨酸甲酯（5.43 %）、苯甲醇（2.02 %）和(2R)-2-羟基-3-甲基-丁腈（5.52 %）（图 2b）。然而，在DL中，2-甲基丁醛、己醛、3-蒈烯、(+)-4-蒈烯、吲哚、3-异亚硝基-2,4-戊二酮、(2R)-2-羟基-3-甲基-丁腈、丁酸-3- 己烯酯和己酸-3-己烯酯完全消失，而芳樟醇氧化物（芳樟醇氧化物 I/II 和反式芳樟醇氧化物）（13.42％）、香叶醇（13.27％）、苯乙醛（28.42％）、苯甲醇（7.97％）、苯甲醛（5.88％）、水杨酸甲酯（15.98％）和乙酸芳樟酯（6.97％）的浓度在整个加工过程中持续增加（图 2b）。

多元统计分析 PLS-DA 表明，在整个红茶加工过程中，挥发性化合物存在显著波动。PLS-DA 模型交叉验证（图 3a 和 b）表明，在整个红茶加工过程中，该方法在区分挥发性成分方面具有很高的准确度。Q ² 值高于 0.95，表明红茶加工对挥发性化合物有显著影响。此外，我们观察到 Q ² 和 R ² Y 值分别为 0.992 和 0.999。此外，Q ² 与 Y 轴的截距小于 0，表明该模型在没有过度拟合的情况下具有较强的预测能力。在区分加工阶段时，并非所有挥发性成分都发挥着关键作用。经过 PLS-DA 分析，VIP > 1.5 的化合物被确定为关键的差异挥发性物质，并被筛选出来进行进一步研究，我们共筛选出VIP 值＞ 1.5的VOCs 成分19 种 （图 3c）。

在检测到的 157 种挥发性化合物中，有 24 种化合物是新生成的。相比之下，有 80 种挥发性化合物在加工过程中下降到可以忽略不计的程度，其余 53 种 VOCs 在加工阶段显示出波动水平。

2.2 不同加工阶段挥发性代谢物的关键属性

据报道青草味是由芳香族化合物产生的，例如己醛、2-甲基丁醛、丁酸-3-己烯酯、吲哚、己酸-3-己烯酯、3-蒈烯和 (+)-4-蒈烯。我们发现上述化合物（包括3-异亚硝基-2,4-戊二酮和(2R)-2-羟基-3-甲基-丁腈）的含量在加工过程中逐渐减少，最终在干燥叶中消失。值得注意的是，香叶醇、苯甲醇、芳樟醇氧化物（芳樟醇氧化物 I/II 和反式芳樟醇氧化物）、苯乙醛、水杨酸甲酯、苯甲醛和乙酸芳樟酯作为最终茶产品中的主要挥发性成分，含量增加。干燥叶中苯乙醛、香叶醇和芳樟醇氧化物的含量明显高于鲜茶叶。上述化合物与红茶的花香和甜香呈现出良好的相关性。这些特征挥发性化合物（ P < 0.05,VIP > 1.5）表明，红茶加工促进了挥发性化合物的积累，尤其是萜类和醛类化合物。此外，我们发现，在云抗10号红茶中检测到的所有挥发性化学物质中，醛类化合物占了近25%，是最常见的一类成分。在发酵过程中，醇类成分发生氧化形成醛类成分，导致茶的香气从青草气、烘烤香、花香或甜香转变为水果香，并将苯乙醇和苯甲醇转化为苯乙醛和苯甲醛。苯乙醛在茶叶中具有花香和蜂蜜般的香气，水杨酸甲酯在茶叶的整体香气中起着至关重要的作用，可赋予茶叶花香和甜香，苯甲醇和芳樟醇赋予红茶花香，香叶醇赋予红茶玫瑰香，这是云抗10号红茶的特点。在红茶中，芳樟醇含量从FTL中的5.31％增加到DL中的7.97％。芳樟醇被认为是红茶的特有香气化合物，主要在发酵过程中由葡萄糖苷水解产生。通常，苯乙醇、芳樟醇及其氧化物（呋喃类化合物）主要来源于 β-葡萄糖苷酶催化的反式芳樟醇 3,6 氧化物-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、顺式芳樟醇 3,6-氧化物-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、   乙酸芳樟酯 β-D-吡喃葡萄糖苷和丙酸-2-苯乙酯 β-D 吡喃葡萄糖苷的水解。在干燥过程中，茶叶中的美拉德反应有助于芳樟醇及其氧化物的含量增加，丰富了红茶的香气。类胡萝卜素的分解也促进芳香挥发物的产生。在红茶的整个加工过程中，Ⅰ类挥发性化合物，主要包括酮类、醛类（如反式-2-己烯醛、庚醛和己醛）和具有青草气的醇类，在萎凋和发酵过程中会迅速增加，然后在干燥过程中急剧下降。相反，II 类挥发性化合物主要为酚类、酯类（如水杨酸甲酯）和萜烯类（如香叶醇、芳樟醇和苯乙醛），该类化合物具有甜香和花香，在干燥过程中保持较高水平（图 2b），有利于干茶风味大幅上升。

3. 通过 LC-MS（UHPLC-Q Exactive HF/X）和多元统计分析进行非挥发性代谢物分析

我们使用 Progenesis QI 软件，通过正负离子模式下的定性匹配分析鉴定出 2642 种代谢物。其中 1890 种代谢物（正离子模式下 1032 种，负离子模式下 858 种）满足统计分析的碎片化分数标准 ≥50 和 RSD 标准 ≤30。FTL、WL、RL、FL 和 DL 的基峰色谱图显示所有样品的信号检测稳健且峰值容量显著。我们对非挥发性代谢物进行了多元数据分析，以检查红茶加工阶段的变化。在分析过程中，我们通过质量控制样品 (QC) 观察到实验平台性能稳定，如 PCA 图所示（图 SM 1），QC样品表现出紧密的聚类性，确保了测试数据的可靠性。这种聚类还证明了我们使用 LC/MS（UHPLC-Q-Exactive HF/MS）的非靶向方法具有良好的稳定性和可重复性。PCA 得分图表明整个红茶加工过程中非挥发性化合物发生了显著变化，在正离子和负离子模式下均显示出明显的样品分离（图 4a 和 b）。PC1和PC2在正离子模式下解释了总方差的54.10%和21.80%（图4c），在负离子模式下解释了60.5%和21.5%（图4f）。代谢物谱准确地对每个阶段的样品进行了分类，凸显了加工对茶代谢组的重大影响。我们观察到各个加工阶段之间有明显的分离，尤其是在 FL 和 DL 之间，这表明在最后阶段代谢物发生了显著的变化。我们使用PLS-DA来观察加工阶段之间的变化（图 4d 和 g）。与 PCA 结果一致，PLS-DA得分图显示不同加工阶段的非挥发性成分之间存在明显差异。PLS-DA 生成的置换图表明该模型具有强大的预测能力，且不会过度拟合（图 4e 和 h）。经过 200 次置换后，ESI ⁺ 的 R ² 截距值为 0.999，ESI ^- 的截距值为 1.0，相应的 Q ² 值分别为 0.992 和 0.996。这些结果表明该模型具有良好的可信度和可解释性。R ² 衡量拟合优度，而 Q ² 决定模型在置信度检验中的预测能力。图 4e 和 h 中显示的 200 次置信度检验表明，多元统计分析的结果是可靠的。

经多元统计分析，我们共找出50余种差异特征代谢物（VIP > 1.5， P <0.01），其中包括18种类黄酮/类黄酮苷，6种有机杂环化合物，4种醇和多元醇，3种氨基酸及其衍生物，2种有机酸，2种苯甲酸及其衍生物，1种羰基化合物，2种苯丙烷类化合物，1种萜类/萜烯糖苷，1种生物碱，1种碳水化合物/糖酸衍生物，以及9种其他成分。

我们采用基于热图可视化的层次聚类分析方法，研究了加工过程中 50 种代谢物含量的差异（图 5）。从图中可以看出，这 50 种生物标志物代谢物发生了明显的变化，其中蓝色代表代谢物含量较低，而红色代表含量较高。

代谢物变化的主要模式有：1）在加工过程中，氨基酸及其衍生物（茶氨酸、L-茶氨酸和替莫普利）含量增加；2）类黄酮化合物和类黄酮糖苷含量降低，包括（金丝桃苷、儿茶素 7-O-没食子酸酯、6”-Caffeoyl hyperin、芦丁、表儿茶素、Theaflavate A、山奈酚 3-鼠李糖-(1->3) (4”-乙酰鼠李糖)(1->6)-葡萄糖苷、红花素 6,7-二葡萄糖苷、(2R) 柚皮素 8-C-α-L-鼠李糖-(1->2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素 3-[鼠李糖-(1->2)-鼠李糖-(1->6)-葡萄糖苷]、Isoneotheaflavin、( − )-表儿茶素没食子酸酯、    (-)-表阿夫儿茶精-3-没食子酸酯、槲皮素），而(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯、夏佛托苷、(+/ − )-儿茶素和6''-O-乙酰黄豆黄苷在加工过程中呈上升趋势。3) 乙醇和多元醇呈增加趋势（5-对香豆酰基奎宁酸、3-没食子酰基奎宁酸、奎宁酸和4-对香豆酰基奎宁酸）。4) 有机杂环化合物中，3-吲哚丙烯酸、氧化保棉磷和5’-羟基吡罗昔康随加工过程呈下降趋势，而甲乙双酮、吲哚啉和乙基麦芽酚随加工过程呈上升趋势。5) 有机酸中，香草酸4-O-葡糖苷酸随加工过程呈上升趋势，而异柠檬酸随加工过程呈下降趋势。6) 苯甲酸及其衍生物中，2,6-二没食子酰葡萄糖含量随加工过程呈上升趋势，而没食子酸甲酯含量随加工过程呈下降趋势。7) 羰基化合物（Keto-1,4-对苯醌）随加工过程呈上升趋势。8) 苯丙素类化合物（鞣花酸和 Sanguiin H4）随加工过程呈上升趋势。9) 生物碱（23-乙酰氧基茄氨酸）随着加工的进行而增加，并在干燥阶段达到最大值。10) 碳水化合物/糖酸衍生物（葡萄糖酸）在干燥阶段先减少，后增加，最后减少。11) 其他代谢物在加工过程中表现出上下波动。热图分析显示了氨基酸、醇类和多元醇、羰基化合物、苯丙素、萜类/萜烯糖苷和生物碱的积累，在类黄酮和类黄酮苷中，发生积累的是(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯、夏佛托苷、(+/ − )-儿茶素和6''-O-乙酰黄豆黄苷，在有机杂环化合物中，甲乙双酮、吲哚和乙基麦芽酚发生积累，在有机酸化合物中，香草酸-4-O-葡糖苷酸发生积累，在苯甲酸和衍生物中，2,6-二没食子酰葡萄糖发生积累，其他代谢物（对苯醌A和脱镁叶绿酸a）也发生积累。

3.1 氨基酸及其衍生物

在红茶加工过程中，我们发现氨基酸和衍生物存在显著变化（ P < 0.01）。L-茶氨酸是红茶风味的关键氨基酸之一，在干燥阶段含量会增加。茶氨酸以丰富感官特征而闻名，红茶的甜味和鲜味在干燥阶段有所提高。我们发现L-茶氨酸在萎凋阶段相对稳定，这与Fang等人的结果一致，他们的结果还表明萎凋后某些氨基酸会增加。茶氨酸和 L-茶氨酸在加工的初始阶段（FTL）较低，但在发酵叶中显著上升，然后在最后阶段（DL）下降。替莫普利的含量在鲜茶叶中升高，在发酵（FL）阶段下降，在干燥（DL）的最后阶段再次达到峰值。

3.2 有机酸

我们发现的主要有机酸是香草酸-4-O-葡糖苷酸和异柠檬酸，它们在发酵阶段会减少，据 Xiao等人报道，一些有机酸在发酵过程中显著减少 ( P < 0.05)。我们发现异柠檬酸在WL中含量最高，在DL中含量低，可忽略不计。相反，香草酸-4-O-葡糖苷酸在干燥阶段的增量可以忽略不计，香草酸-4-O-葡糖苷酸赋予了红茶甜香，并可增强感官特征，可以补充红茶的天然风味。红茶变得滑润、醇厚、酸苦味减少的一个关键因素可能就是这些代谢产物的变化。

3.3 类黄酮化合物/类黄酮苷

热图分析和单因素方差分析表明，在红茶加工过程中，有19 种类黄酮化合物及其糖苷之间存在显著差异 ( P < 0.01)。四种不同的类黄酮化合物及其苷类：(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯、夏佛托苷、6''-O-乙酰黄豆黄苷和山茱萸新苷在加工过程中显著增加（ P < 0.05），在干燥阶段达到最大值，而其余十五种代谢物包括金丝桃苷、儿茶素 7-O-没食子酸酯、6''-O-乙酰黄豆黄苷、芦丁、表儿茶素、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯、Theaflavate A、山奈酚-3-鼠李糖-(1->3) (4”’-乙酰鼠李糖)(1->6)-葡萄糖苷、夏佛托苷、红花素 6,7-二葡萄糖苷、(2R)-柚皮素-8-C-α-L-鼠李糖-(1>2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素3-[鼠李糖(1->2)-鼠李糖-(1->6)-葡萄糖苷]、Isoneotheaflavin、(-)-表儿茶素没食子酸酯、( − )-表儿茶素-3-没食子酸酯、(+/ − )-儿茶素、6''-O-乙酰黄豆黄苷和槲皮素在萎凋阶段表现出显著变化，在加工过程中含量显著下降（ P < 0.05），在干燥阶段含量最低。大多数儿茶素化合物的显著减少很可能是由于儿茶素在萎凋过程中通过聚合反应和缩合转化为茶黄素。前期大量文献报道了黄酮和黄酮醇对茶汤苦味和涩味的显著影响。因此，黄酮和黄酮醇的转化或降解可能会影响红茶独特的口感。在红茶加工过程中，类黄酮化合物和类黄酮糖苷在多酚过氧化物酶和氧化酶的作用下发生酶促氧化，导致其浓度降低。氧化引起茶黄素和茶红素的形成，从而赋予红茶香气、风味和特征颜色。这种转变对于形成红茶独特的感官特性和整体品质至关重要。儿茶素易受高温影响，因此在加热和储存过程中都容易异构化和降解。此外，在揉捻和发酵过程中，儿茶素会因多酚过氧化物酶和氧化酶的自氧化分解而减少。在揉捻过程中，茶叶受到的压力会导致液泡膜破裂，可能使多酚氧化酶和酚氧化酶与儿茶素接触，从而引发氧化。该过程可促进中间体邻苯二酚的形成，这些邻苯二酚在红茶的揉捻和发酵过程中发生反应，生成茶黄素和茶红素，茶黄素和茶红素是一种酚类衍生物。这些化合物的形成使茶叶颜色从绿色变为铜褐色，同时随着发酵的进行，茶叶的香气也发生了显著变化。表没食子儿茶素(EGC )和表儿茶素(EC)含量的降低可以归因于多酚化合物（如儿茶素）的氧化，其中苯并卓酚酮将它们转化为具有浓郁香气的棕色物质。此外，在加工过程中，儿茶素化合物的减少与云抗 10 号茶叶中检测到的游离氨基酸含量增加相关，这可能会增强茶叶的浓郁口感，并赋予茶叶柔滑醇厚的风味。

3.4 乙醇和多元醇

红茶中发现的主要非挥发性差异代谢物是 5-对香豆酰基奎宁酸、3-没食子酰基奎宁酸、4-对香豆酰基奎宁酸和奎宁酸，它们在红茶加工过程中表现出显著（ P < 0.01）的变化。4-对香豆酰基奎宁酸在WL中含量最低，在FL和DL中含量最高，而 5-对香豆酰基奎宁酸在萎凋阶段含量最低，在FL中含量最高，然后在DL中再次降低。奎宁酸从揉捻阶段开始逐渐增加，在DL中的含量最高。3-没食子酰基奎宁酸含量在 WL 中可以忽略不计，在 FL 中较低，在 DL 中增加。奎宁酸（多元醇）主要形成茶的涩味和酸味，在萎凋阶段其含量显著降低。3-没食子酰基奎宁酸是形成平地茶颜色的主要因素，也是形成茶的鲜味的因素。4-对香豆酰基奎宁酸和5-对香豆酰基奎宁酸在发酵后呈降低趋势。在萎凋过程中，茶叶失去水分，这可能引起多元醇等非挥发性化合物略有浓缩，但在此阶段没有针对醇和多元醇的特定转化或反应。在揉捻过程中，细胞壁会破裂，可引发氧化反应。

3.5 生物碱、有机杂环化合物、苯甲酸及其衍生物、羰基化合物、苯丙素、碳水化合物/糖酸衍生物和其他微量非挥发性代谢物

本研究发现的生物碱是23-乙酰氧基茄氨酸，它在加工阶段表现出显著的变化，其含量在RL中可以忽略不计，在揉捻后逐渐增加。6种有机杂环化合物在红茶加工过程中表现出显著 ( P < 0.05) 的变化，其中3-吲哚丙烯酸 (吲哚及其衍生物)、氧化保棉磷、5’-羟基吡罗昔康呈下降趋势，而甲乙双酮、吲哚啉和乙基麦芽酚在加工过程中显著增加。这种下降趋势可能是由于氧化、降解和新化合物形成，引起其浓度和性质发生变化；而一些有机杂环代谢物的含量增加则可能是由于前体化合物的形成和释放，以及去除水分过程中的浓缩效应引起的。微量的3-吲哚丙烯酸为红茶增添了香气和风味，而氧化保棉磷、5’-羟基吡罗昔康、甲乙双酮、吲哚啉和乙基麦芽酚对红茶品质的影响通常不如微量的儿茶素、类黄酮化合物和生物碱那么重要。苯甲酸及其衍生物如2,6-二没食子酰葡萄糖，在加工过程中表现出了显著的变化，其在FL中含量最低，在DL中含量最高，它对红茶的涩味、颜色、抗氧化特性和整体感官特性都有贡献，提高了红茶的品质，而有助于抗氧化特性的没食子酸甲酯在加工过程中显著下降。羰基化合物Keto-1,4-对苯醌在加工过程中有所增加，在DL中含量最高，它通过增强香气、风味、颜色和化学稳定性来提高红茶的品质，表明羰基代谢物是重要的风味成分，可以通过脂质降解产生。在本研究中，葡萄糖酸（碳水化合物/糖酸衍生物）作为一种差异代谢物，其含量在 RL 中可忽略不计，随后在 FL 中上升，在 DL 中为微量，表明尽管在加工过程中存在微生物的活动或发酵，但红茶中仍可能存在微量的葡萄糖酸。苯丙素类成分包括鞣花酸和 Sanguiin H4 。在本研究中，苯丙素含量表现出显著变化，在干燥样品中达到峰值。红茶中的苯丙素有助于提高其风味、香气、抗氧化特性、颜色和化学稳定性，从而提高其整体品质。在其他微量非挥发性代谢物中，对苯醌A 和脱镁叶绿酸A表现出显著变化，它们在萎凋、揉捻和发酵阶段含量较低，但在干燥阶段含量增加，其中脱镁叶绿酸A在干燥阶段含量最高。对苯醌A，也称为 5-O-咖啡酰奎宁酸，可能有助于红茶的抗氧化特性、颜色稳定性和潜在的健康益处。脱镁叶绿酸 A 是一种叶绿素衍生物，可能会影响样品颜色并可能具有抗氧化特性。在红茶加工过程中，所有其他微量非挥发性代谢物均显著减少。

4. 加工阶段大分子化合物的动态变化

Duncan 检验的单因素方差分析显示，在加工过程中，大分子化合物的变化显著。游离氨基酸、水浸出物、茶多酚和可溶性总糖显著降低（ P < 0.05），而茶黄素、茶红素和茶褐素则显著增加（ P < 0.05）（图 6）。同样，没食子酸呈现出显著上升趋势（ P < 0.05），总儿茶素呈现下降趋势，而咖啡因含量和四种茶黄素化合物呈现不显著的上下波动。

本研究中，总可溶性糖含量显著下降（ P < 0.05），FTL和DL中表现出明显差异，然而在萎凋、揉捻和发酵样品中，我们没有观察到明显的差异。FTL中的可溶性糖含量为 6.18%，而DL中的可溶性糖含量降至3.88%，这很可能是因为采摘后的茶叶失去了光合作用，糖合成能力丧失，导致萎凋过程中葡萄糖和果糖含量显著降低。内源酶将糖分解成单糖，导致蔗糖等双糖减少，在发酵和干燥过程中，蔗糖含量可以忽略不计。蔗糖的水解导致萎凋后果糖和葡萄糖含量增加。揉捻过程后，果糖、葡萄糖和半乳糖等单糖的存在可以增强红茶的甜味。研究者已证实，红茶经揉捻后，由于光合作用能力的丧失，呼吸作用消耗糖分，大分子糖类被酶促分解，蔗糖等双糖减少，以及单糖的积累，导致可溶性糖含量降低。水浸出物含量在加工过程中显著（ P < 0.05）下降，FTL含量最高，为29.12％；发酵叶和干燥叶中水浸出物含量无显著差异，分别为22.32%和21.68%。水浸出物含量的下降是由于加工过程中可溶性化合物的浸出、酶促氧化、发酵以及化合物溶解度的改变，导致在水中的可提取性降低。在本研究中，在萎凋和揉捻阶段，茶叶样品中的总氨基酸含量变化不显著，但在发酵和干燥阶段，总氨基酸含量显著下降。游离氨基酸含量在萎凋阶段呈现上升趋势（3.95%），随后逐渐下降，在干燥样品中约为 2.83%。氨基酸在决定茶叶的味道和颜色方面起着不可或缺的作用。氨基酸含量的上升可归因于细胞破裂产生的肽酶和蛋白酶或来自糖的氨基酸对蛋白质的降解。红茶的每个加工阶段茶多酚含量显著降低，从鲜叶中的 31.38% 开始，在萎凋、揉捻、发酵和干燥后降低至 14.83%。这种下降与茶叶加工过程中多酚的聚合、氧化和转化等化学变化有关。萎凋会引起茶叶的物理化学变化，降低水分含量，增强细胞膜的通透性，同时也有助于茶叶香气的形成。萎凋后的茶叶更容易揉捻，细胞结构会进一步被破坏，多酚的酶促氧化加速。红茶色素（如茶黄素、茶红素和茶褐素）的含量在加工过程中显著增加。鲜茶叶中的茶黄素含量为 0.01%，萎凋后的茶叶中茶黄素含量增加到 0.04%。在加工的前两个阶段，茶红素的含量无明显变化，在揉捻、发酵、干燥过程中，茶红素的含量明显增加，分别达到了0.16%、0.33%和0.42%。在FTL、WL、RL、FL和DL中，茶红素的含量分别为2.94%、4.04%、5.09%、6.01%和7.03%，茶褐素的含量分别为1.95%、2.78%、3.94%、5.05%和7.21%。

本研究中，儿茶素 (C)、表儿茶素 (EC)、表没食子儿茶素 (EGC)、表儿茶素没食子酸酯 (ECG) 和表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG) 均显著 ( P < 0.05) 下降 (图 SM 2)，在FTL中的相对含量分别为 3.42 mg/g、7.07 mg/g、15.30 mg/g、13.78 mg/g 和 26.75 mg/g；在DL中的相对含量分别下降至0.98 mg/g、1.36 mg/g、1.92 mg/g、1.05 mg/g 和 1.01 mg/g，这些化合物在整个加工阶段呈现逐渐下降趋势。红茶加工过程中没食子酸含量变化显著：FTL、WL、RL、FL和DL中没食子酸含量分别为 1.34 mg/g、1.70 mg/g、3.59 mg/g、3.16 mg/g 和 2.27 mg/g（表 4）。揉捻阶段没食子酸含量急剧增加，这与Miao等人的研究结果一致。咖啡因含量在加工过程中变化不显著，FTL、WL、RL、FL和DL中的咖啡因含量分别为27.08 mg/g、32.70 mg/g、33.17 mg/g、32.52 mg/g和 32.07 mg/g。在四种主要茶黄素化合物中，茶黄素在经过萎凋后出现（表 4），在揉捻和发酵阶段，茶黄素含量达到最高，随后逐渐下降，这种下降可能是由于茶黄素的分解或转化为不同物质（如茶红素）引起的。发酵过程中形成的茶黄素被表儿茶素醌进一步氧化，生成茶红素。在加工的最后阶段，茶黄素(TF)含量为 0.95 mg/g，依次是茶黄素-3-没食子酸酯(TF-3-G），含量为0.70 mg/g，茶黄素-3’-没食子酸酯(TF-3’-G)，含量为 0.58 mg/g，3,3'-二没食子酸酯茶黄素(TFDG)，含量为 0.57 mg/g。在揉捻和发酵过程中，TF 和 TF-3’-G 分别从1.85 和 0.75 mg/g显著下降到 1.31 和 0.63 mg/g，而 TF-3-G 和 TFDG 含量几乎没有变化。

表4 红茶加工过程中儿茶素（儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯）、没食子酸、咖啡因和四种茶黄素化合物（茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3’-没食子酸酯和3,3'-二没食子酸酯茶黄素）含量的动态变化

注：ND表示未被检测到，每种样品重复3次，数据以平均值±标准差表示。上标不同小写字母（a、b、c、d、e, P< 0.05）表示经单因素方差分析（Duncan’s多重比较检验）测定差异有统计学意义。

本研究采用均匀设计（UD）法对云抗10号红茶的加工工艺进行优化，重点优化了萎凋时间、发酵时间和发酵温度。根据UD实验设计进行试验，最佳参数为萎凋时间14 h、发酵时间5.6 h、发酵温度34℃。我们在此条件下进行验证实验，并对优化后的样品进行代谢组学和HPLC分析。通过对157种VOCs和2642种代谢物的分析，我们鉴定出19种关键香气活性化合物（VIP> 1.5）和50种特征代谢物（ P <0.01，VIP> 1.5），突出了各个加工阶段对云抗10号红茶香气属性和整体品质的影响。非挥发性化合物以类黄酮/类黄酮糖苷类为主，挥发性化合物以萜类化合物为主，19种挥发性化合物中，芳樟醇氧化物（芳樟醇氧化物I、芳樟醇氧化物II、反式芳樟醇氧化物）、香叶醇、苯乙醛、苯甲醇、苯甲醛、水杨酸甲酯、乙酸芳樟酯等在干燥样品中富集，这些物质赋予红茶独特的颜色和风味。在非挥发性代谢物中，我们在加工过程中观察到氨基酸及其衍生物的积累。本研究深入了解了红茶加工过程中代谢成分的波动，为未来提高红茶营养价值和感官品质的研究提供了宝贵的指导。然而，这些代谢成分的生物学作用及其潜在的健康益处需要通过有针对性的生化和临床研究进一步验证。未来的研究应侧重于通过体内和体外研究来确定这些化合物对健康的影响。本研究通过阐明茶叶加工过程中挥发性和非挥发性组分的动态变化，有助于研究者对红茶每个加工步骤如何影响代谢物形成的科学理解。