导读：
流感病毒是一种全球性流行的呼吸道疾病，每年导致300万至500万严重流感病例、29万至65万与流感有关的呼吸道死亡。接种疫苗是预防和控制流感病毒的有效措施。当前成熟的流感疫苗技术为灭活病毒疫苗、流感病毒亚单位疫苗。但由于流感病毒极易发生变异，造成现有流感疫苗的保护效力不足（40~60%），因此亟需开发新的流感疫苗技术，如mRNA疫苗。
信使RNA (Messenger RNA, mRNA)在日益疫苗接种和蛋白质替代疗法等方向成为新的治疗方案，但一般基于脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticle, LNP)的mRNA递送系统具有肝脏偏好性。对于治疗性mRNA来讲，实现其靶向递送是首要目的。
近两年研究表明，通过单克隆抗体偶联LNP（Ab-LNP）的策略能够将mRNA成功递送至靶细胞。这一方面，美国宾夕法尼亚大学Drew Weissman（诺奖得主）、Michael J Mitchell和Hamideh Parhiz等发表多篇高质量研究。今天的文章，菌菌追溯到2023年诺贝尔医学奖得主Drew Weissman早期（2018年）发表的一篇Ab-LNP的经典研究。
美国宾夕法尼亚大学研究人员曾在
Journal of Controlled Release（影响因子10.5）
上发表题目为
《PECAM-1 Directed Re-Targeting of Exogenous mRNA Providing Two Orders of Magnitude Enhancement of Vascular Delivery and Expression in Lungs Independent of Apolipoprotein E-Mediated Uptake PECAM-1》
的文章。文中宣布，他们将核苷修饰的mRNA-LNPs与血管细胞粘附分子PECAM-1特异性抗体(Antibodies, Abs)结合，Ab/LNP-mRNA独立于载脂蛋白E(Apolipoprotein E, apoE)，可将mRNA靶向递送到小鼠肺部。这使得mRNA-LNP在许多心血管、神经和肺部疾病的治疗成为可能。今天，由菌菌带大家详细解读这篇文献。
mRNA给药后不会特异性递送至某个器官或者细胞，这是限制其在不同疾病领域发展的关键瓶颈。最近热门的抗体与mRNA-LNP偶联，似乎是一种可行的解决途径，使其递送的准确性变得可及。血管腔内的内皮细胞是许多心血管、神经和肺部疾病的药物干预目标。
利用结合内皮表面决定因子
CD31
（又称血小板内皮细胞粘附分子
-1 (P
latelet-endothelial
C
ell
A
dhesion
M
olecule-1
, PECAM-1)
）等的抗体和其他亲和配体，已经实现了多种药物和载体对肺和部分血管区域的内皮靶向。
文中披露的LNP脂质组分摩尔比为，可电离的阳离子脂质：磷脂酰胆碱：胆固醇：聚乙二醇脂质=50:10:38.5:1.5，同时为了实现偶联，作者在脂质中加入了马来酰亚胺官能团（DSPE-PEG-mal）。其中mRNA的浓度为1μg/μL，并用N1-甲基假尿苷对其进行修饰。抗体则经由N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫乙酸酯(N-Succinimidyl-S-Acetylthioacetate, SATA)进行功能化地引入巯基从而允许与马来酰亚胺偶联，随后使用G-25 Sephadex快速旋转蛋白柱去除未反应的成分。紧接着利用硫醚偶联法将抗体上的活性巯基偶联到马来酰亚胺上，完成LNP与抗体的偶联。最后，作者利用Sepharose CL-4B凝胶过滤柱对其进行了纯化。因此，作者通过SATA-马来酰亚胺将靶向抗体或同型对照的IgG偶联到LNP颗粒上。
作者通过在偶联过程中对抗体进行放射性标记，发现每个偶联颗粒约80个抗体分子。如图1所示，将针对于内皮细胞表面标记物的抗体偶联到LNP-mRNA后与未偶联的LNP-mRNA对比，发现IgG/LNP-mRNA 和 PECAM-1 Ab/LNP-mRNA颗粒的平均值增加到约100 nm，而未偶联的LNP-mRNA为82.5±1.8nm（图 1 B、C），但两者的形态无明显区别（图 1D、E）。
图1 含有脂质纳米颗粒的靶mRNA的表征
PECAM Ab/ LNP-mRNA体外靶向内皮细胞
CD31 （即PECAM-1）主要由内皮细胞表达，作者将PECAM Ab/LNP-mRNA与稳定表达PECAM-1的人类间皮瘤REN细胞（REN-PECAM）和野生型REN细胞进行共培养以在体外验证是否可以靶向内皮细胞。结果发现PECAM Ab/LNP-mRNA与REN-PECAM相结合，而与野生型REN细胞无法结合（图2A）。而后将携带荧光素酶、增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP)的LNP-mRNA以不同浓度加入REN细胞中，发现该mRNA编码的荧光素酶和eGFP的PECAM呈依赖性表达（图2B、C）。
根据结果得知，PECAM Ab/LNP-mRNA可在体外靶向内皮细胞。
图2 靶向颗粒在体外的结合和功能活性
PECAM-1 Ab/mRNA-LNPs体内靶向肺部血管内皮细胞
接下来，作者测定了mRNA-LNPs在体内对血管内皮的靶向作用。通过静脉注射用125I标记的LNP-mRNA，测定小鼠体内每克组织注射剂量的百分比(%ID/g)来研究LNP-mRNA与组织结合的情况。未偶联的LNP-mRNA主要在肝脏中积累（图3A、E），IgG/LNP-mRNA在肝脏累积较少，血液和脾脏中积累的更多（图3A、D）。IgG/LNP-mRNA在器官和细胞中积累可能是因为IgG的包被直接或间接抑制肝脏摄取而导致的血液水平升高，而且IgG/ LNP-mRNA对主要靶点如内皮细胞没有亲和力否则就会被肝脏的大量摄取所取代。
文献报道称，PECAM-1为血管输送到肺部提供了靶点，与报道结果相似，PECAM-1 Ab/LNP-mRNA在肺累积达到105.03±3.5%ID/g（图3A），与IgG/LNP-mRNA相比增加了16倍。进一步给定器官中%ID/g的比例，归一化到血液水平来分析免疫特异性指数。如图3B示，较未偶联抗体或IgG/LNP-mRNA相比，靶向抗体后对肺血管的递送增强约200倍。继续进行动力学分析，PECAM-Ab/LNP-mRNA主要在肺部积累，肺特异性摄取在注射后60分钟是快速且持续的但在血液中清除迅速（图3C）。
图3 LNP-mRNA 在体内靶向 PECAM-1
接着评估了PECAM-1靶向LNPs在体内的细胞分布，作者将细胞膜绿色荧光探针DiO (dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate)标记的LNPs与抗PECAM-1结合并静脉注射到小鼠体内。用流式细胞术分析肺部组织，
发现4%的细胞是CD31+内皮细胞（图4A），其中100%的内皮细胞为LNP呈阳性（图4B），表明内皮细胞对靶向颗粒的高度摄取。
图4 流式细胞术分析肺部组织中PECAM-1靶向LNP的细胞分布
为了评估未偶联和Ab偶联LNPs对细胞代谢活性的影响，对LNP处理后的REN细胞进行了细胞毒性实验。结果如图5A所示，
LNPs与细胞孵育48小时后，细胞存活率仍高于90%。
继续评估LNP处理后的人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)对炎症的促进作用，发现LNP-mRNA处理对促炎标志物VCAM的表达无显著影响。为了确定LNP-mRNA处理是否会影响体内促炎细胞因子的表达，在小鼠静脉注射LNP-mRNA，与未处理的小鼠相比，体内LNP-mRNA处理后血浆IL-6和肝脏MIP-2没有升高（图5C、D）。
根据结果得知，Ab偶联LNPs对细胞并无毒性和促炎反应，说明了其安全性。
图5 LNP-mRNA的细胞毒性和促炎反应
前期研究证实，在静脉注射4-5小时后，mRNA递送的蛋白表达可以达到峰值，作者得到相似结果，未偶联、IgG和PECAM Ab/LNP-mRNA在4.5 小时后达到最大表达，并在接下来的24小时内缓慢下降（图6A）。
因此在体内静脉注射后4.5小时后，作者检测了组织的荧光素酶的表达情况。经眶后注射携带萤光素酶的未偶联LNP-mRNA，结果导致荧光素酶主要在肝脏表达，在脾脏表达水平较低（图6B、C）。较未偶联LNP-mRNA相比，
PECAM Ab/LNP-mRNA在肺中表现出约20倍的表达（图6B、D），较未偶联LNP-mRNA和IgG/LNP-mRNA相比，肺/肝比值分别增加了200倍和50倍（图6E）。
图6 静脉注射LNP-mRNA后，荧光素酶mRNA表达情况
之前的研究表明载脂蛋白E(Apolipoprotein E, apoE)介导肝脏对LNP-mRNA的摄取，作者利用apoE敲除小鼠证实，较野生型小鼠相比，递送携带荧光素酶mRNA-LNP后，apoE敲除小鼠的肝脏荧光信号降低，在其他器官中也观察到较低的荧光强度（表1）。apoE敲除小鼠抑制肝脏摄取而不重新分配到其他器官的一个可能的解释是，LNPs对其他器官几乎没有亲和力。
然而，PECAM Ab/LNPs在apoE敲除小鼠的肺中积累，与野生型动物相比，PECAM-1 Ab/LNP-mRNA递送后，apoE敲除小鼠肺中的荧光素酶活性没有显著降低（图7）。
图7 在apoE敲除小鼠中mRNA的荧光素酶表达情况
表1 静脉注射Luc mRNA-LNPs对apoE敲除小鼠荧光素酶活性的定量测定
作者发现利用抗体偶联核苷修饰的mRNA-LNPs可以实现小鼠的全身mRNA递送，为小鼠肝脏以外的器官提供了高效的血管免疫靶向。
该系统使用修饰的核苷来减少先天免疫激活并增加体内mRNA的蛋白质翻译，在4-24小时的时间段内，可以在肺部测量到萤火虫荧光素酶编码mRNA的特异性、快速和瞬时蛋白表达，并显示了内皮细胞对Ab mRNA-LNPs的有效摄取。
