蓝晶实验室•iGEM项目解读系列 | 2017 William_and_Mary

随着生物技术的发展，合成生物学工作者逐渐建立了基因表达调控的方法，我们可以通过调节启动子、核糖体结合序列、操纵子等多种元件来控制基因的表达量。一个控制良好的遗传线路不仅需要能够在加入一个输入信号时，对应得到预设的输出信号，而且需要这个输出信号能够在短期内迅速达到比较稳定的输出值。这就需要对遗传线路的基因表达动力学参数进行研究，控制和调节遗传线路反应速度。基于此，W&M团队通过对基因表达数学模型的分析，开发了一套便捷的方案来控制基因表达速度。

基因表达的简单动力学模型

首先，设想一个基因组成型表达，其蛋白质生成速率为α，降解速率为γ；由于转录、翻译过程与蛋白质浓度无关，因而蛋白质浓度x随时间变化的微分方程可以简单的表示为dx/dt=α-γx。求解可得蛋白浓度x与时间t的关系为：x(t) = α·γ^(-1)·(1-e^(γ^t))。不难发现，时间取正无穷时，x的最大浓度趋近于α/γ，经过简单的计算即可求得x浓度达到最大浓度的一半所需的时间仅与γ相关，因此只需增大或减小γ，即可缩短或延长遗传线路所需的反应时间。

遗传线路反应速度与分解速率γ成反比

在蛋白质末端添加多肽标签，通过改造控制标签与蛋白酶的结合力，在特定蛋白酶存在的情况下，即可不同程度地加快蛋白降解速度，即增大γ值，从而不同程度地缩短了线路反应时间。为了避免与大肠杆菌内部蛋白水解系统互相影响增大预测难度，W&M团队选择了来源于支原体的Mesoplasma florum Lon (mf-Lon)蛋白酶系统：一方面，mf-Lon系统与大肠杆菌内在系统存在良好的正交性；另一方面，只需要在原有遗传线路上简单地添加一个编码降解信号肽标签的生物学元件即可达到控制特定蛋白降解速度率的目的。

Mf-Lon系统的相关研究并未将该系统中所需的元件放在质粒上研究，为了便于合成生物学工作者使用，W&M团队首先尝试将各元件克隆到质粒并导入大肠杆菌中进行测试，结果发现改造的系统仍可改变蛋白质降解速率。

同时，由于W&M团队要研究的是蛋白质浓度与时间的关系，需要测定的特定时间点蛋白浓度（荧光信号强度），为此，他们进行了多重尝试，最终发现在待测时间点将细胞迅速至于冰上，可起到暂停蛋白合成与降解的效果，蛋白浓度可以稳定地保持一段时间，在此期间完成检测荧光强度的工作即可。

基于上述两点前期工作，W&M团队在组成型表达的荧光蛋白末尾连接不同的降解标签，发现改变蛋白质的降解速率确实加快了遗传线路的反应速率，并且加快程度与降解标签强度成反比例关系。

线路反应速度与降解速率成反比

从上述模型可知，γ不仅影响反应速度，同样会影响蛋白质的最大浓度。对于许多遗传线路，蛋白质的最大浓度是十分重要的。因此，必须在通过改变γ调整线路反应速率的同时，设计方案使系统达到稳定时的蛋白质最大浓度与γ改变前保持一致。经分析后发现，在改变γ的同时，等比例地改变α值，即可达到保持蛋白质最大浓度的目的，W&M团队认为在实际工作中，可以通过改变启动子和RBS的强度实现该目的。但是在该项目中，为了简化问题，W&M团队选择通过改变诱导物浓度的方式来控制α的大小。通常情况下，增加启动子的强度和提高诱导物浓度的原理都是增加启动子与诱导物的结合效率，因此这两种方法本质上是一致的。从结果中可以看到，当加入降解标签E，同时把诱导物ATC从50 ng/mL升至85 ng/mL后，遗传线路的反应速度受到影响。

通过调节α与γ达到改变线路速度但保持蛋白最大浓度的目的

更进一步，W&M团队希望利用这样一套蛋白质降解体系模拟包含X、Y、Z三种蛋白的前馈体系，并通过改变降解标签的强度达到控制体系的目的。原始体系中，输入信号引起X表达，X可以促进Y和Z表达，而Y可以抑制Z表达。因此，输入信号引起X表达后， Z的含量会迅速提升随后下降至稳定状态，形成“脉冲”，理论上改变X对Z的促进作用或Y对Z的抑制作用可以改变Z随时间变化过程中蛋白浓度变化的曲线形态。

X、Y、Z三元素组成的前馈线路

W&M团队利用蛋白质降解系统，设定所表达的荧光蛋白为Z，通过同时添加诱导目标蛋白表达的诱导剂ATC和诱导蛋白酶表达的IPTG，使得荧光蛋白迅速表达，但随后受蛋白酶的影响迅速降解，从而出现“脉冲”。但与原始线路不同的是，一方面，W&M团队改造的体系对于蛋白质的调控是翻译后水平而非转录水平；另一方面，可以通过调整添加在目标蛋白后的降解标签强度，很容易地控制脉冲的尖锐程度，从而达到简便地控制线路效果的目的。

基于蛋白酶和降解标签的前馈系统

此外，W&M团队还通过与美国马里兰大学的合作，验证了该体系在一个铜离子传感器线路中的作用，证实了体系的现实价值和实用性。同时，他们整理了实验过程中产生的BioBrick，便于后续iGEM队伍的应用。