蓝晶实验室•iGEM项目解读系列 | 2017 William_and_Mary

随着生物技术的发展，合成生物学工作者逐渐建立了基因表达调控的方法，我们可以通过调节启动子、核糖体结合序列、操纵子等多种元件来控制基因的表达量。一个控制良好的遗传线路不仅需要能够在加入一个输入信号时，对应得到预设的输出信号，而且需要这个输出信号能够在短期内迅速达到比较稳定的输出值。这就需要对遗传线路的基因表达动力学参数进行研究，控制和调节遗传线路反应速度。基于此，W&M团队通过对基因表达数学模型的分析，开发了一套便捷的方案来控制基因表达速度。

基因表达的简单动力学模型

首先，设想一个基因组成型表达，其蛋白质生成速率为α，降解速率为γ；由于转录、翻译过程与蛋白质浓度无关，因而蛋白质浓度x随时间变化的微分方程可以简单的表示为dx/dt=α-γx。求解可得蛋白浓度x与时间t的关系为：x(t) = α·γ^(-1)·(1-e^(γ^t))。不难发现，时间取正无穷时，x的最大浓度趋近于α/γ，经过简单的计算即可求得x浓度达到最大浓度的一半所需的时间仅与γ相关，因此只需增大或减小γ，即可缩短或延长遗传线路所需的反应时间。

遗传线路反应速度与分解速率γ成反比

在蛋白质末端添加多肽标签，通过改造控制标签与蛋白酶的结合力，在特定蛋白酶存在的情况下，即可不同程度地加快蛋白降解速度，即增大γ值，从而不同程度地缩短了线路反应时间。为了避免与大肠杆菌内部蛋白水解系统互相影响增大预测难度，W&M团队选择了来源于支原体的Mesoplasma florum Lon (mf-Lon)蛋白酶系统：一方面，mf-Lon系统与大肠杆菌内在系统存在良好的正交性；另一方面，只需要在原有遗传线路上简单地添加一个编码降解信号肽标签的生物学元件即可达到控制特定蛋白降解速度率的目的。

Mf-Lon系统的相关研究并未将该系统中所需的元件放在质粒上研究，为了便于合成生物学工作者使用，W&M团队首先尝试将各元件克隆到质粒并导入大肠杆菌中进行测试，结果发现改造的系统仍可改变蛋白质降解速率。

同时，由于W&M团队要研究的是蛋白质浓度与时间的关系，需要测定的特定时间点蛋白浓度（荧光信号强度），为此，他们进行了多重尝试，最终发现在待测时间点将细胞迅速至于冰上，可起到暂停蛋白合成与降解的效果，蛋白浓度可以稳定地保持一段时间，在此期间完成检测荧光强度的工作即可。

基于上述两点前期工作，W&M团队在组成型表达的荧光蛋白末尾连接不同的降解标签，发现改变蛋白质的降解速率确实加快了遗传线路的反应速率，并且加快程度与降解标签强度成反比例关系。

线路反应速度与降解速率成反比