2019年8月NSFC放榜之后，时间已经进入十月份。十一长假一晃而逝，接下来2020年国自然的申请，应该提上日程。
今天我们来看看：“
2020年国自然CRISPR/Cas9和耐药相关项目研究设计
”。
2019年度国家自然科学基金申请项目评审结果早在8月份就已公布，
生命科学部和医学科学部一共资助近17000项，总资助金额近77亿元。
经初步统计，其中涉及CRISPR的研究达67项，资助金额达3286万，项均资助49万多元。
CRISPR相关研究
……
本文仅显示部分项目，更多项目详情，请在后台回复
关键词
“
2019年CRISPR
”获取。
CRISPR/Cas9被认为是耐药功能基因筛选的高效工具。
在2019年的国自然中标项目中，涉及耐药相关研究的中标项目高达408项，总资助金额近1.6亿元，项均资助近39万元。
耐药相关研究
……
本文仅显示部分项目，更多项目详情，请在后台回复
关键词
“
2019年耐药
”获取。
在实际的研究过程中，使用CRISPR/Cas9文库进行耐药相关的功能基因筛选时，依然有很多问题需要考虑，比如：
1
如何设置实验对照？
CRISPR/Cas9筛选实验主要有哪些对照？
2
只想比较对照/处理，可以不设置基线对照吗？
不设置基线对照的筛选实验只能以对照样本作为比较的基础，即只能进行2种条件间的比较。
3
CRISPR/Cas9筛选的测序对象是什么？
CRISPR-Cas9筛选测序依赖于sgRNA频率，sgRNA频率通过携带这种sgRNA的细胞数目体现，因此建库测序对象是通过sgRNA慢病毒文库整合到细胞基因组中的sgRNA表达元件部分。
在筛选阶段，并不针对sgRNA的靶向区域进行建库测序，即不评价sgRNA的编辑效率和结局。
4
CRISPR/Cas9筛选过程中的最低覆盖倍数是多少？
由于sgRNA慢病毒文库中含有的sgRNA数目很大（例如，全基因组KO文库一般含有120 k sgRNA，全基因组SAM文库一般含有60-70 k sgRNA），为了保证sgRNA频率的稳定性，必须维持合理的文库覆盖度，具体的覆盖度设置受细胞可获得性、病毒用量可接受性等因素综合影响，从100×-1000×均有使用。
吉凯基因
通过原创的建库技术，可以对≥100×覆盖的样本进行高质量测序和分析。
5
如何理解细胞增殖在CRISPR/Cas9筛选过程中对覆盖度的影响？
文库覆盖度可以分为细胞感染时病毒的初始多样性（original diversity）投入和筛选过程中细胞增殖的放大多样性两种。
初始多样性是文库覆盖多样性的全部基础，放大多样性是为了更好的维持初始多样性。
我们建议使用尽可能高的初始文库覆盖多样性，并以一致的覆盖度维持整个细胞筛选过程。
例如，当使用100×文库病毒开始筛选实验后，在全部的细胞实验过程中，均保持100×以上的细胞覆盖，即任何时刻的细胞数量不能低于100×。
对于一个典型的3时间点/处理对照筛选：
收取100×细胞作为基线样本的前提是此时的细胞至少有200×，收取100×后还有至少100x用于后续实验；
当细胞要分为处理/对照两支的前提是此时的细胞至少有200×，可以各分100x进行对照和处理实验；
每个对照/处理点的收取100×细胞作为样本的前提是此时的细胞至少有200×，收取100×后还有至少100x用于后续实验。
6
如何理解测序文库覆盖度，与病毒、细胞的文库覆盖度有何区别？
文库测序的覆盖度计算公式为：
总sgRNA reads/sgRNA文库总数，是一个和初始多样性、细胞增殖放大多样性相关又不同的概念。
大多数时候的测序覆盖度只与测序量有关，不受初始多样性的限制。
需要提示的是，测序量中的reads对应于一个个具体的DNA分子，由于并非所有投入测序的DNA分子都可以被测序，测序reads需要大于DNA分子数，才能让更多的DNA被测到。
例如，对于初始多样性为100x的样本，我们建议每个收样点的细胞量也是100x，然后进行300x的测序。
吉凯基因
提供高质量文库病毒和测序分及分析服务，文库测序服务合作客户发表最高影响因子15分
。进一步了解
CRISPR/Cas9筛选相关的服务和技术要求
，请联系
吉凯基因
售前咨询顾问
18516626958
咨询，并索取相关资料。
