相分离应该也算是近期比较热点的研究方向，夏老师在PubMed上冲浪的时候，就看了这么一篇浙大医学院第一附属医院钱鹏旭团队的两位博士后，发表在17.3分的Nature子刊Nat Cell Biol上的文章，这篇文章做的相分离真的是很不错了：
这篇文章研究的对象是AML（急性髓系白血病），首先他们对AML细胞进行了一轮CRISPR筛库，通过筛选他们发现FBL可能是AML中潜在的关键致癌基因：
那么这个FBL是否对于AML的形成起到了关键作用呢？他们就对AML细胞进行了FBL的敲减（这里其实就是柯霍氏法则的验证，以此确定FBL对于AML的功能产生了什么样的影响，不清楚柯霍氏法则的话，可以看看《轻松的文献导读》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》），结果发现敲减了FBL之后AML细胞在体内、外引发的白血病发生都受到了抑制：
既然FBL有这么明显的功能，那么它具体是干嘛的呢？FBL是一种保守的核仁蛋白，它有三个比较关键的结构域，一个是N端富含甘氨酸-精氨酸的结构域GAR，第二个是RBD（RNA结合结构域），还有一个是C端的α螺旋结构域，RBD和这个α螺旋结构域形成了MD（甲基转移酶结构域）。FBL的四个赖氨酸残基（Lys102/121/205/206）的乙酰化，会减弱H2AQ104me（rDNA转录激活标志）和rRNA的合成。但是他们通过对这四个K进行了突变（模拟乙酰化和无法乙酰化，这些突变验证其实是对于蛋白质功能验证的一个比较严谨的方法，不是单纯敲除或者过表达，而是单独验证功能位点的突变，可以有效避免肯定后件的逻辑谬误，不清楚肯定后件逻辑谬误的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）后发现，并没有对AML细胞造成什么样的影响，也就说明了FBL对rDNA转录的调控，并不是其影响AML的关键。那么甲基转移酶结构功能突变呢？他们也对甲基化转移酶功能结构进行了突变，也没产生什么影响，也就是说FBL的rRNA甲基化功能也不是其影响AML细胞的关键：
FBL还有一个功能，就是促进核仁中DFC（致密纤维成分）相的形成（核仁是一种多层液体凝聚物，由不同且共存的子室组成，DFC会促进核糖体生物发生），将新生的前 rRNA 引导至DFC以进行PS（液液相分离）介导的加工。大家都知道要产生相分离，就需要有IDR（无规则序列）。他们做了两种实验，一个是用非IDR序列去取代了GAR结构域中的IDR，另一个是改变了GAR结构域在FBL中的位置（这个步骤，其实就是在原有的假设前提下，进行了进一步的迭代，通过这样的假设迭代以及验证，推进了整个课题的进展，不清楚假设迭代的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《列文虎克读文献》），结果发现缺失了IDR的GAR结构域无法再起到作用，但和GAR结构域具体位置无关。有意思的是用其他蛋白的IDR序列替换掉GAR结构域中的IDR，也会使得FBL的相分离功能失活，也就是说FBL中的相分离产生是需要有特殊IDR序列的。突变缺失了RBD结构域，也会影响PS的形成。
他们发现FBL的全长或者GAR结构域加上GFP荧光后，都能形成PS液滴，但是单独的MD结构域（包含RBD和α螺旋的）不能形成PS液滴。于是他们假设RBD结合的rRNA可能参与了FBL中GAR结构域导致的PS形成，然后在这三组实验中分别加入了rRNA。结果发现加入rRNA后，全长FBL形成的PS液滴明显增多，而单独的GAR结构域和单独的MD结构域没有变化。也就是说RBD通过异型相互作用促进rRNA产生区域的蛋白质积累，促进了PS液滴形成。而GAR则能驱动蛋白质自聚集，将FBL锚定在与纤维中心相邻的DFCs内：
对于FBL的突变实验，也说明了FBL的PS特性调控，可能与其生物学功能有关。FBL是核仁特异性表达的蛋白，它对于核仁的影响会造成核仁形态改变和核糖体生物发生的异常。通过对于GAR和RBD结构域的突变（他们将命题的外延缩小到了GAR和RBD的结构上，而非蛋白的表达与否，这样就可以从功能上，来进行验证，从而避免了肯定后件的逻辑谬误，不清楚命题以及外延的话，还是需要进一步了解一下科研的逻辑和推理哦，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》），他们发现对于FBL的功能，也就是rRNA的切割和修饰，也受到了FBL的PS形成影响，过FBL中GAR同型和GAR-RBD异型相互作用的凝聚，会控制rRNA分配到DFCs中，从而增加核仁数量，并促进AML细胞中 rRNA 的切割和修饰：
而核仁对核糖体合成至关重要，FBL影响了核仁的功能，也会间接影响核糖体功能。于是他们对于FBL的PS相关结构突变对于翻译的影响进行了检测，结果发现，FBL缺失后JAK-STAT等相关通路受到了抑制（JAK-STAT信号通路是炎性相关的比较关键的信号通路，特别是JAK-STAT下游还能激活MYC这样的原癌基因，不熟悉的话可以看看《信号通路是什么鬼？》系列），也就是说FBL的PS形成相关的结构域和原癌基因的翻译有着密切关联：
知道了FBL在AML中的关键作用，但是又特异性FBL抑制剂，于是他们想着，既然FBL的PS形成缺失，会特异性地阻碍rRNA的切割和修饰，那么用靶向rRNA加工的化合物是不是能抑制FBL功能。于是他们就使用了CGX-635，这个是能抑制rRNA切割的化合物。结果显示CGX-635的确能通过与FBL的直接相互作用，引发FBL异常的PS液滴形成：
而使用了CGX-635从药理学角度抑制了FBL的PS液滴形成后，对于AML形成的白血病也得到了有效的抑制：
最后形成了这样一个示意图，高表达FBL中的GAR结构域可以形成PS液滴，而RBD结构域通过结合rRNA形成支架，促进了FBL形成PS液滴，通过PS液滴驱动DFC形成。在核仁中促进了rRNA的修饰和切割，加速了包括MYC在内的一些原癌蛋白反应，促进了AML白血病形成。而通过CGX-635抑制FBL的PS液滴形成，可以有效杀死AML细胞：
这篇文章在对于FBL的相分离验证过程，无疑是十分严谨的，通过对于FBL的结构域的一步步地拆解，最终发现了FBL相分离对于核仁功能的贡献。并且在没有FBL抑制剂的条件下，通过抑制rRNA，抑制了FBL的PS液滴形成，最终杀死AML细胞。总的来说这篇文章在相分离研究中，应该算是一篇相当优秀的研究论文了。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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