HISAT2，取代TopHat的宠儿

以前做过一期TopHat用法的推文，但是在TopHat的网站上可知，如下图，TopHat的最后一个版本TopHat 2.1.1更新于2/23/2016，并且官方团队已经明确声明，后续将大力发展HISAT2。最新的HISAT2 2.1.0版本推出于6/8/2017，相比于TopHat，HISAT2有着相同的核心功能并且更加高效，所以我们有必要学习一下HISAT2的用法。

       HISAT2的使用可分成三步：建立基因组index，reads比对到基因组和sort排序。

我们首先要从网上下载人类的注释文件human.gtf 和基因组信息hg38.fa

       先从human.gtf中提取外显子和剪切位点信息。

       extract_splice_sites.py human.gtf > human.ss

       extract_exons.py human.gtf > human.exon

       然后我们需要使用hisat2-build进行建库：

       hisat2-build -p 5 --ss humangenome.ss --exon humangenome.exon hg38.fa hg38_tran

       除了自己建库以外，HISAT2官方网站也给出了可以直接使用的Indexes下载地址：http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml。由于自己建库的时间比较长，这里笔者建议大家首选官方的Indexes。

假设我要用的双端测序样本为A_1_trimmed.fq 和A_2_trimmed.fq，官方下载的index在grc目录下：

       hisat2 -p 5 --dta -x ./grc/genome -1 A_1_trimmed.fq -2 A_2_trimmed.fq     -S A.sam > A.txt

       我们使用了5个线程运行程序，这一步的运行速度是要远快于TopHat的，并且只生成一个sam文件，我们可以将运行日志保存在A.txt文件里。

TopHat的结果是会自动排序的，这样排序后的结果可以直接用于下一步的reads组装。但是HISAT2是需要手动对sam文件进行排序的：

       samtools sort -@ 5 -o A.bam  A.sam

       我们使用5个线程对sam文件排序，并将结果保存为bam二进制格式。

       就像之前我们使用的TopHat+cufflinks一样，我们同样可以使用HISAT2+cufflinks进行转录本分析，可以用HISAT2得到的A.bam文件作为cufflinks的输入文件进行基因表达量矩阵计算和差异表达分析。另外，我们也可以用最新的套装HISAT2+StringTie做分析。

       TopHat和HISAT2出于同一个团队，HISAT2在2016年更新了4次，今年到现在为止更新了一次，可以看到该团队对HISAT2的支持力度是很大的，相信如果有什么比对算法上的改进也是放在HISAT2上面，所以这里笔者建议大家用HISAT2代替tophat作为新一代的比对软件。

       这期就到这里了，下期再见 ~^o^~