组织来源的细胞外基质(tdECM)水凝胶通过促进再生免疫反应，可作为组织再生的有效支架。虽然大多数tdECM水凝胶都是纳米多孔的，适合软组织，但大孔性对于骨再生至关重要。然而，用于此目的的大孔ECM水凝胶却很少。
基于此，来自美国斯坦福大学杨帆团队
开发了一种共纺技术将骨来源的ECM (bECM)整合到基于明胶的大孔微带(μRB)支架。研究结果表明，共纺明胶/bECM水凝胶是一种有前途的大孔支架，可用于强大的内源性骨再生，而无需外源性细胞或生长因子。
相关研究成果以
“Incorporating Bone-Derived ECM into Macroporous Microribbon Scaffolds Accelerates Bone Regeneration”
为题于2024年2月1日发表在
《Advanced Healthcare Materials》
上。
1.微带(μRB)支架的制备
作者首先将不同比例的bECM前体溶液与甲基丙烯酸酯明胶(GelMA)溶液混合，以获得不同重量比的bECM (0%、15%、25%、50%)（图1a）。然后通过调整实验室之前报告的湿纺策略将bECM/明胶共纺成μRB形状。为了可视化 bECM 的掺入，用红色荧光染料标记了bECM。共聚焦成像显示荧光强度呈剂量依赖性增加，μRB中的bECM分布均匀（图1b、c）。
SEM显示，所有bECM μRB组均保留了大孔隙率，随着ECM剂量的增加，表面会变得更光滑（图1d）。质谱分析证实，大多数bECM蛋白为胶原蛋白亚型，辅以其他非胶原蛋白和ECM调节剂（图1e、f）。基因本体(GO)富集分析确定了与软骨内骨形态发生、骨形态发生和骨化相关的蛋白质，这表明分离的bECM含有具有可增强成骨作用的生物学功能的蛋白质
。
图1 含bECM的μRB支架的制造和表征
2.bECM μRB支架的表征
作者测量了刚度、溶胀率和降解情况，以进一步评估加入不同剂量的bECM对其他支架物理性质的影响
。流变学测试表明，将bECM增加至25%不会显著改变μRB支架的刚度。进一步将bECM增加到50%会显著降低支架刚度，在第0天和第2周也观察到了相同的趋势（图2a、b）。溶胀率分析显示出类似的趋势，从0%到25% bECM组没有显著变化，50% bECM组的溶胀率明显高于50% bECM组（图2c），表明交联密度降低。bECM被物理包裹在共价交联的明胶中，而增加bECM比例会降低μRB中的交联密度，从而导致更高的溶胀率。为了表征支架降解情况，测量了两周内的质量损失，发现各组之间没有显著差异（图2d）。根据物理特性，作者选择0-25% bECM μRB支架进行进一步的细胞研究。
图2 具有不同bECM比例的μRB支架的表征
3.bECM μRB支架增强间充质干细胞体外成骨作用
为了评估含有bECM的μRB支架中的MSC成骨作用，将MSC封装在含有不同bECM剂量的μRB支架中，并在成骨培养基中培养长达4周。
早期骨标志物Runx2的免疫染色显示，增加bECM剂量显著上调了Runx2表达，在15%bECM时达到峰值并达到饱和（图3a、c）。成熟骨标志物骨钙素(OCN)的免疫染色显示，到第24天，各组之间没有统计学差异（图3b、d）。
为了评估骨基质的形成，进行了组织学检查。茜素红S (ARS)染色显示15% bECM组导致最强的矿化骨形成（图3e、f）。无细胞支架的Masson三色染色显示，随着bECM剂量的增加，总胶原染色增加，表明胶原来自bECM。通过比较细胞和无细胞染色，可以观察到 15% bECM 组中细胞产生的胶原蛋白量很少，但不如矿化基质产生量丰富。总之，这些结果证明了将bECM整合到μRB支架中对3D MSC成骨的积极影响，其中15% bECM是加速MSC成骨和促进矿化骨形成的最佳组。
图3 μRB支架的体外成骨作用
4.在bECM μRB支架中添加矿物颗粒可进一步增强体外成骨作用
为了进一步提高bECM支架的成骨特性，将常用的矿物质TCP微粒添加到bECM μRB支架中。
SEM显示TCP微粒的密度较低，这与添加的低剂量一致（图4a）。为了量化不同bECM剂量对μRB支架中MSC成骨的影响，对各种成骨标志物进行了免疫染色和蛋白质印迹分析。Runx2的免疫染色确定15% bECM为主要组，其次是25% bECM（图4c、d）。第24天的OCN染色也证实了15% bECM为主要组（图4e、f）。虽然单独使用bECM或TCP都可以促进成骨作用，但它们的协同作用似乎在中等bECM浓度下效果最好。
总体而言，在存在TCP的情况下，15% bECM仍然是领先组，这在体内得到了进一步验证。
图4 含有TCP微粒的bECM μRB支架可增强体外成骨作用
5.含有矿物颗粒的bECM μRB支架支持体内快速、强劲的内源性骨再生
先前研究利用纳米多孔bECM水凝胶进行骨再生，并显示出与使用生长因子或干细胞类似的积极效果。然而，这些结果仅限于免疫功能低下的动物和皮下植入。
为了进一步增强临床转化的相关性，接下来使用免疫功能正常的小鼠临界大小颅骨缺损模型评估了含有矿物质的bECM μRB支架对支持内源性骨再生的功效。
MicroCT 成像显示，早在第2周，15% bECM 组就出现了快速的新矿化骨形成，54%的原始骨缺损被填充（图5a、b）。所有组都显示出一定程度的矿化骨形成，到第3周达到饱和，到第4周保持稳定。0% bECM和25% bECM μRB组分别导致到第4周约20%和约50%的骨体积填充。15%组在第1周到第2周之间骨再生速度最快，新骨量增加了三倍。骨矿物质密度(BMD)的变化也呈现出类似的趋势，其中15% bECM组增幅最大。
为了进一步评估新生骨的形态，在第4周采集样本进行组织学分析。H&E染色和Masson三色染色显示0% bECM组仅存在一层薄薄的纤维组织，而15%和25% bECM组均显示骨缺损处有稳健的组织形成（图5c）。鉴于血管化是骨再生的关键因素，作者对CD31进行了免疫染色。与骨形成的趋势相似，15% bECM组诱导的血管化程度最高，约为0% bECM对照的七倍（图5e、f）。这些结果表明，含TCP的15% bECM 组是支持稳健内源性骨形成的最有效的支架组合物，与显著增强的血管化和适度增加的干细胞募集有关。
图5 含有TCP微粒的bECM μRB支架可增强体内内源性骨再生
M𝜑是骨损伤的早期反应者，生物材料也可以通过调节M𝜑极化来影响骨再生。
研究结果表明，加入bECM可显著减少M1 M𝜑的存在和表达，表明消除急性炎症有助于增强骨再生（图6）。
图6 含有TCP微粒的μRB支架中添加bECM可在体外和体内以剂量依赖性方式降低M1 M𝜑极化
综上，本文报告了一种使用湿纺将不同剂量的bECM掺入大孔μRB支架的方法。骨再生需要免疫调节、干细胞募集、成骨和血管化的协调。通过结合体外细胞研究和体内小鼠模型，作者证明当bECM剂量增加到25%时，bECM μRB支架降低了M1 M𝜑表型并增加了干细胞募集。结果表明，含有15% bECM的明胶μRB支架是诱导强劲内源性骨再生的最佳成分，同时伴有显著增强的血管化和成骨作用。低剂量的TCP矿物质能够最大限度地发挥其增强骨再生的益处。
参考资料：
https://doi.org/10.1002/adhm.202402138
来源：
EngineeringForLife
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